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人多生牙根尖牙乳头干细胞和牙髓干细胞的生物学表型和转录组特征的分析及临床病例报告

人多生牙根尖牙乳头干细胞和牙髓干细胞的生物学表型和转录组特征...

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作者：柴涟福建医科大学

学位级别：硕士

目的:从口腔中分离培养牙源性干细胞是再生医学研究的热点。目前,口腔来源的人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla of human teeth,sCAPs)和人牙髓干细胞(dental pulp stem cells of human teeth,dpscs)已被证明具有... 详细信息

目的:从口腔中分离培养牙源性干细胞是再生医学研究的热点。目前,口腔来源的人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla of human teeth,sCAPs)和人牙髓干细胞(dental pulp stem cells of human teeth,dpscs)已被证明具有较好的干细胞特性。寻找具有较好干细胞特性的牙源性干细胞,实现体外诱导形成牙体硬组织样材料,以弥补传统牙体修复材料在硬度和磨耗度上与天然牙差异性较大的缺点,是口腔医学界一直以来的研究方向。本课题组早期研究发现,与恒牙来源的dpscs相比,多生牙来源的人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla of human supernumerary teeth,sCAP-ss)具有更好的干细胞特性。然而,来源于同一颗多生牙的这两种干细胞的生物学特征和转录组特征却缺乏进一步的对比研究。本实验的目的就是为了对比3颗来源于同一多生牙的sCAP-s和牙髓干细胞(dental pulp stem cells of human teeth,dpscs-s)在生物学特征和转录组特征方面的差异,为实现体外诱导形成牙体硬组织样材料应用于临床挑选一个合适的“种子”细胞。方法:本研究的样本来源于临床拔除的多生牙,选择3颗多生牙,经过分离后,采用酶消化法分别对sCAP-ss和dpscs-s两种干细胞进行体外培养;细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法对两种细胞第0、1、2、3、4、5天的吸光光密度(optical density,OD)值进行检测,来验证细胞的增殖能力;通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测sCAP-ss和dpscs-s的免疫表型;通过细胞周期、凋亡和衰老来验证细胞活力;成脂诱导液和成骨诱导液诱导sCAP-ss和dpscs-s成脂成骨分化后,将分化的细胞分别行油红O和茜素红染色,以比较sCAP-ss和dpscs-s成脂和成骨能力,再结合实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测多系分化潜能。同时,我们利用转录组测序和生物信息学分析来剖析它们之间的差异。结果:通过本研究,我们发现3颗多生牙所对应的sCAP-ss和dpscs-s在形态学和免疫表型上表现出相近的特征,sCAP-ss和dpscs-s细胞在形态上均表现出典型的长梭形;二者均高表达间充质相关生物标志物(CD73、CD90、CD105)和低表达造血相关表面标志物(CD34、CD45);二者在细胞周期与凋亡比例方面均无显著差异,而在细胞活力和多谱系分化、基因表达谱和差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)相关基因本体(gene ontology,GO)和信号通路上表现出多样性。从生长曲线图中,我们发现sCAP-ss在指定时间点内比dpscs-s在体外显示出更好的增殖能力;通过典型的油红O染色和茜素红染色,我们得出sCAP-ss在成脂和成骨分化方面具有优越性,并通过检测脂肪相关基因(ADIPOQ、PPAR-γ)和成骨相关基因(RUNX2、BGLAP)进一步证实;从RNA测序和生物信息学分析结果来看,sCAP-ss和dpscs-s之间基因表达模式有多方面变异;通过京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库的信号分析,我们得出sCAP-ss和dpscs-s之间指示信号传导的差异。结论:本研究表明,人多生牙来源的sCAP-ss在细胞和分子水平上的多种特征优于dpscs-s,这为sCAP-ss作为“种子”细胞应用于体外培养牙体硬组织样材料的再生医学领域研究提供了新的参考依据。

关键词： sCAP-s dpscs-s 生物学表型细胞活性与分化转录组测序

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