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dpp6在难治性颞叶癫痫患者及匹罗卡品致痫大鼠脑组织中的表达

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DPP6在难治性颞叶癫痫患者及匹罗卡品致痫大鼠脑组织中的表达

作者：赵振英山东大学

学位级别：硕士

目的：癫痫是一种脑部疾病状态,以具有能够产生癫痫发作的持久易患性和出现相应的神经生物、认知、心理及社会等方面的后果为特征。据估计全球约5000万人罹患癫痫。尽管服用多种抗癫痫药物,仍有30%的患者不能有效控制癫痫发作,称为难治... 详细信息

目的：癫痫是一种脑部疾病状态,以具有能够产生癫痫发作的持久易患性和出现相应的神经生物、认知、心理及社会等方面的后果为特征。据估计全球约5000万人罹患癫痫。尽管服用多种抗癫痫药物,仍有30%的患者不能有效控制癫痫发作,称为难治性癫痫。颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫,但是,难治性癫痫的发病机制还不完全清楚。通过对难治性癫痫患者及动物模型的脑组织标本研究发现树突棘存在重构,推断树突棘重塑在癫痫发生中起重要作用。二肽基肽酶6 (dipeptidyl peptidase 6, dpp6)是一种单次跨膜糖蛋白,在海马神经元树突丝足和树突棘的形成和稳定中发挥重要作用。本文通过比较dpp6在难治性癫痫患者与脑外伤患者颞叶脑组织、匹罗卡品致痫大鼠模型脑组织与对照组脑组织中的表达差异,探讨dpp6在难治性癫痫发生发展中的意义及可能的作用机制,为抗癫痫治疗提供一种新思路。方法：在癫痫患者脑组织库中,按照随机化原则随机抽取27例难治性颞叶癫痫患者的脑组织,在对照组脑库中抽取15例组织学正常的脑外伤患者的颞叶脑组织,采用Western Blot、免疫组织化学对dpp6的表达量和表达部位进行测定。另外采用氯化锂-匹罗卡品大鼠致痫模型,分别在大鼠癫痫发作后6h、24h、72h、 1w、2w、1m、2m(n=49)断头取脑,与对照组(n=7)比较,采用Western Blot、免疫组织化学、免疫荧光双标对dpp6的表达量和细胞定位进行测定,进一步探讨dpp6在难治性癫痫发生发展中的作用。结果：1癫痫患者组和对照组1.1临床特点比较：癫痫组共27例,平均病程12.11+1.42年。92.6%的患者病程超过5年,55.6%的患者病程超过10年。对照组共15例,实验组和对照组在年龄、性别、所取脑组织的部位方面差异无统计学意义。1.2 Western Blotting示颞叶癫痫患者脑组织dpp6的蛋白表达水平明显高于对照组。通过计算dpp6/GAPDH的相对光密度(OD)值,比较两组的平均OD值,癫痫组平均OD值(0.86±0.04),对照组平均OD值(0.37+0.02),两组间差异有统计学意义(Pdpp6主要表达于癫痫组和对照组的颞叶脑组织神经元的细胞膜。对照组的平均OD值为0.21±0.03,癫痫组的平均OD值为0.50±0.02,两组间差异在统计学上有意义。2动物模型2.1 Western Blotting示,癫痫组颞叶脑组织中dpp6在各个时间点的表达逐渐增加,与对照组相比差异有统计学意义(Pdpp6在急性期(6h、24h)、慢性期(1m、2m)表达增加,潜伏期(1w、2w)比急性期表达减少,但各个时间点与对照组相比表达均增加,差异具有统计学意义(Pdpp6主要表达于神经元细胞膜,与对照组相比,表达均增加,且与Western Blot有相似的表达趋势。2.3免疫荧光双标示在1m癫痫大鼠颞叶和海马中,dpp6与MAP2共表达,与GFAP不共表达,说明dpp6主要表达于神经元,在神经胶质细胞中不表达。结论：***6在难治性癫痫患者颞叶脑组织和匹罗卡品致痫大鼠模型脑组织中的表达均增高。***6主要表达于神经元细胞膜,在神经胶质细胞中不表达。***6在难治性癫痫的发生发展中可能起重要作用。

关键词：颞叶癫痫 dpp6 树突棘突触重塑

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dpp6在不同动物种属心脏中的表达

DPP6在不同动物种属心脏中的表达

作者：王婵娟河北医科大学

学位级别：硕士

瞬时外向钾电流(I)是心肌细胞动作电位复极1期的主要成分,能影响动作电位形态和动作电位时程。瞬时外向钾通道由孔区亚单位Kv4(Kv4.3或Kv4.2)形成的同源四聚体和辅助亚单位共同构成,目前比较公认的辅助亚单位是钾通道相互作用蛋白2(KChI... 详细信息

瞬时外向钾电流(I)是心肌细胞动作电位复极1期的主要成分,能影响动作电位形态和动作电位时程。瞬时外向钾通道由孔区亚单位Kv4(Kv4.3或Kv4.2)形成的同源四聚体和辅助亚单位共同构成,目前比较公认的辅助亚单位是钾通道相互作用蛋白2(KChIP2)和二肽基肽酶样蛋白亚型6(dpp6)。KChIP2在心脏表达分布以及在I通道中的功能已有较深入的了解,dpp6为单次跨膜蛋白,最初发现于中枢神经,能够加速Kv4电流的衰减和通道的复活。近年有报道,dpp6基因突变可引发家族特发性室颤(idiopathic ventricular fibrillation),我们前期的实验发现,dpp6中介通道调节剂NS5806对不同种属动物I不同的药理反应,提示dpp6辅助亚单位在心脏I通道的重要作用。然而目前dpp6在动物心脏的表达分布情况了解甚少。已知dpp6存在多种剪接异构体,其中最常见的是dpp6-L(长)和dpp6-S(短)两种剪接体。本课题检测dpp6-L和dpp6-S在不同动物种属心脏、心脏不同区域的表达情况,预期为揭示dpp6的生理功能提供实验依据。方法:1.首先利用qRT-PCR方法,检测dpp6-L和dpp6-S在小鼠左心室中的mRNA表达。因为先期发现dpp6的mRNA在脑组织中有显著表达,因此本实验以小鼠的脑组织作为阳性对照。PCR引物基于N端胞内域不同的序列设计。2.利用Western blot方法,观察dpp6-L和dpp6-S在小鼠、大鼠、兔、犬心脏(不同部位)以及人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)中蛋白的表达。本实验所用的抗体是兔抗人dpp6的31666氨基酸残基的多克隆抗体,可同时检测dpp6-L和dpp6-S。3.观察I调节剂NS5806对离体心脏QTc(心率矫正后的QT)间期的影响,进一步在功能上验证dpp6对于I通道的调节作用。成年SD大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,迅速开胸取出心脏,置Langendorff灌流装置灌流,记录心电图(相当于体表心电图的Ⅱ导)。稳定后观察10μM NS5806对心电图的影响,测量QT、RR间期,计算连续10个QRS波群的平均值,得出QTc(心率矫正后的QT)间期的变化。结果:***6在小鼠左心室的mRNA表达小鼠脑组织中dpp6-S的mRNA表达量较高,dpp6-L有一定的mRNA表达,这和之前的文献报道相一致。然而,dpp6-L和dpp6-S在小鼠的左心室中mRNA表达量都较低,几乎检测不到。***6在不同种属动物心脏的蛋白表达由于缺乏dpp6-L和dpp6-S两种亚型的特异性抗体,我们基于以往报道脑组织中有dpp6-L和dpp6-S两种亚型表达,以dpp6-S为主,以小鼠的脑组织作为阳性对照,在脑组织中的条带中低表达且分子量稍大的条带为dpp6-L,分子量约为115 KDa;高表达且分子量稍小的条带为dpp6-S,分子量约为105 KDa。结果表明,在小鼠脑组织中以dpp6-S表达为主,dpp6-L的表达较少,这和之前的文献报道相一致。在小鼠左心室中以dpp6-L表达为主,dpp6-S几乎不表达;在hiPSC-CMs中以dpp6-L的表达为主,dpp6-S表达较少;在犬的左心室中以dpp6-S的表达为主,很少的dpp6-L表达。已知心脏的I电流密度存在显著的区域差别,我们进一步检测了dpp6在心脏的不同部位的表达。结果表明,大鼠心脏(左室内膜下、中层和外膜下组织以及右心室、室间隔、心房),小鼠心脏(左室内膜下和外膜下组织以及右心室、室间隔、心房)以及兔心脏(左心室、右心室、左心房、右心房)等不同部位均以dpp6-L的表达为主,且其蛋白表达量在心脏不同部位并无显著性差异。***5806对Langendorff离体灌流大鼠心脏心电图的影响10μM NS5806显著延长大鼠离体ECG的QTc间期,从给药前的139ms延长到给药后的265 ms。给药前后采用配对t检验,求出均数和标准差,Pdpp6在动物心脏有显著的蛋白表达,但存在种属差异。大鼠、小鼠及兔心脏表达dpp6-L,人源心肌细胞同时表达dpp6-L和dpp6-S,但以前者为主;相反犬心室肌主要表达dpp6-S。大鼠、小鼠以及兔心脏不同部位的dpp6-L的表达无明显差别。

关键词： dpp6 动物种属 hiPSC-CMs NS5806 Ito

dpp6对豚鼠心室肌细胞电活动的影响及其机制的研究

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DPP6对豚鼠心室肌细胞电活动的影响及其机制的研究

作者：王志华河北医科大学

学位级别：硕士

心室纤颤(ventricular fibrillation)是引起心搏骤停(cardiac arrest)和心脏猝死(sudden cardiac death)最常见的原因,通过对病人的病因学、基因学研究和动物模型研究发现其发生常常是由于心脏离子通道的异常而出现。特发性室颤是遗传... 详细信息

心室纤颤(ventricular fibrillation)是引起心搏骤停(cardiac arrest)和心脏猝死(sudden cardiac death)最常见的原因,通过对病人的病因学、基因学研究和动物模型研究发现其发生常常是由于心脏离子通道的异常而出现。特发性室颤是遗传性室颤的一种类型,由于其病因未知和临床症状隐蔽而具有极高的致死率。前期有研究提示一种家族特发性室颤的发生与二肽基肽酶样蛋白(Dipeptidyl peptidase-like protein,dpp)的亚型6(dpp6,又称dppX)的表达升高密切相关,dpp6的异常高表达可引起家族特发性室颤的病理机制目前未知。dpp6是一种公认的Kv4通道调节亚基,而后者是介导心脏中瞬间外向钾电流(Ito)的主要通道,对正常心律的维持起重要作用,但目前对dpp6在心脏中的作用尤其是对心律失常发生的影响很少有报道,目前认为dpp6异常导致心脏(尤其是浦肯野纤维)Ito电流增大是导致室颤的一个主要原因。虽然dpp6是Kv4通道的调节亚基,但有研究在神经系统发现dpp6除影响A型钾电流外,对钠通道也有影响,并且发现在没有Kv4通道表达的区域也有dpp6的表达。由此我们提出一个重要的问题,dpp6是否对心脏其它的离子通道也具有调节作用进而影响室颤的发生。为回答此科学问题,本研究将在豚鼠心室肌细胞成功过表达dpp6后,通过观测过表达dpp6对豚鼠心室肌细胞动作电位以及相关离子通道(如钠通道、L型钙通道等)的影响来发现其可能的细胞电生理学机制,此研究将为揭示dpp6在某种特发性室颤的病因、病理机制、疾病的预防和治疗提供重要的实验基础,具有重要的基础研究和临床意义。目的:(1)评价腺病毒介导的dpp6过表达载体在豚鼠心室肌细胞的过表达效果(2)过表达dpp6对豚鼠心室肌细胞的动作电位的影响。(3)过表达dpp6对豚鼠心室肌离子通道(钠通道、L型钙通道、IKr、IKs)的影响及机制。方法:(1)利用荧光显微镜观测腺病毒携带的绿色荧光蛋白,实时定量PCR(qPCR)技术,蛋白免疫印迹技术来评价腺病毒介导的dpp6过表达载体在豚鼠心室肌细胞的过表达效率;(2)应用全细胞电流钳技术记录培养后的豚鼠心室肌细胞的动作电位,观察过表达dpp6对心室肌细胞动作电位的影响;(3)利用电压钳技术检测在豚鼠心室肌细胞过表达dpp6对钠通道、钙通道以及IKr、IKs电流的影响及其机制。结果:(1)感染dpp6过表达腺病毒的豚鼠心室肌细胞培养48小时后,用荧光显微镜可观测到心室肌细胞有绿色荧光蛋白的表达;通过qPCR技术检测发现dpp6 mRNA的表达水平明显提高;利用蛋白免疫印迹技术发现dpp6蛋白表达明显提高;(2)过表达dpp6的豚鼠心室肌细胞与对照相比,动作电位时程显著缩短,0相除极速率加快;(3)过表达dpp6的豚鼠心室肌细胞钠电流密度显著增加,激活曲线和失活曲线向超极化方向移动,且激活曲线移动更显著,复活曲线无显著变化;L型钙电流密度显著降低,激活曲线向去极化方向移动,失活曲线无变化;IKr和IKs无明显变化。结论:(1)我们前期构建的腺病毒介导的dpp6过表达载体能够成功感染豚鼠心室肌细胞,可用于相关研究;(2)过表达dpp6致豚鼠心室肌细胞动作电位时程显著缩短,0相除极速率加快,可能与过表达dpp6增加心室肌细胞钠电流,减小钙电流有关,以上结果提示dpp6对心肌电活动的影响可能具有一定的病理意义。

关键词： dpp6 动作电位钠通道钙通道 IKr IKs

腺病毒介导的dpp6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定

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暨南大学学报（自然科学与医学版） 2015年第6期36卷 453-457页

作者：王娜华乐杨甫王珏王志华王琼董梅王川河北医科大学药理学教研室河北石家庄050017 河北医科大学临床医学系河北石家庄050017 河北科技大学校医院河北石家庄050018

目的:构建腺病毒介导的dpp6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达.方法:应用PCR技术扩增目的基因dpp6,经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体p Shuttle-CMV中,进而转化至含有Ad Easy质粒的大肠杆菌中,进行重组;所产生的腺病毒... 详细信息

目的:构建腺病毒介导的dpp6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达.方法:应用PCR技术扩增目的基因dpp6,经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体p Shuttle-CMV中,进而转化至含有Ad Easy质粒的大肠杆菌中,进行重组;所产生的腺病毒载体转染在HEK-293细胞中,进行腺病毒的包装、分泌和扩增,所得病毒感染大鼠心肌细胞,进行荧光及实时定量PCR(q PCR)鉴定.结果:dpp6过表达腺病毒载体构建成功,经HEK293细胞包装、扩增后,所得病毒可成功感染初生大鼠心肌细胞,观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达,q PCR检测dpp6 mRNA表达明显升高.结论:成功构建了腺病毒介导的dpp6过表达载体,并在大鼠心肌细胞内成功表达,为进一步研究dpp6在心肌细胞内的功能奠定了基础.

关键词： dpp6 基因腺病毒载体绿色荧光蛋白心肌细胞

CNTN4中的rs2619566多态性，dpp6中的rs10260404多态性，以及INPP5B中的rs79609816多态性，与中国内陆汉族人群中散发性肌萎缩侧索硬化症密切相关

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CNTN4中的rs2619566多态性，DPP6中的rs10260404多态性，以及INPP...

作者：章建权南昌大学

学位级别：硕士

众所周知,散发性肌萎缩侧索硬化的发病机制目前还不明确,最近的研究显示,遗传因素可能起了重要作用。因此,本研究旨在寻找一些可能与发病机制和诊断相关的遗传因素。我们的全基因组关联研究从中国汉族人群中筛选了250例散发性肌萎缩侧... 详细信息

众所周知,散发性肌萎缩侧索硬化的发病机制目前还不明确,最近的研究显示,遗传因素可能起了重要作用。因此,本研究旨在寻找一些可能与发病机制和诊断相关的遗传因素。我们的全基因组关联研究从中国汉族人群中筛选了250例散发性肌萎缩侧索硬化症病人和250例正常对照组进行了回顾性分析了此前研究公布的SALS的发病相关候选位点。我们利用质谱MassARRAY平台检测和DNA测序技术对募集的一个包含了239例散发性肌萎缩侧索硬化症病人和261例正常对照组的独立样本的基因型的差异性进行质谱分析。从候选位点中挑选了与sALS发病最为密切相关的27个位点,利用DNA测序技术进行进一步分析。从HACM中我们发现CNTN4基因中的rs2619566,dpp6基因中的rs10260404以及INPP5B基因中的rs79609816与sALS的发病密切相关。那些携带了rs2619566的次要C等位基因(CC+CT)和rs79609816的次要T等位基因(TT+TA)的研究对象比其他基因型研究对象有更高的患病风险,在HACM中携带了rs10260404的次要C等位基因(CC+CT)的研究个体与正常对照组相比表现出了更低的sALS患病风险。我们的研究证实,CNTN4基因中的rs2619566,dpp6基因中的rs10260404以及INPP5B基因中的rs79609816在sALS的发病机制中扮演了重要的角色,同时为未来诊断散发性肌萎缩侧索硬化症提供了新的候选基因。

关键词： CNTN4 dpp6 INPP5B 中国汉族人群肌萎缩侧索硬化症