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dnmt1、KIT和KITLG基因的单核苷酸多态性与生精障碍关系的初步研究

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DNMT1、KIT和KITLG基因的单核苷酸多态性与生精障碍关系的初步研究

作者：程攀大理学院

学位级别：硕士

男性不育是一种由遗传，环境，饮食等诸多因素引起的多基因遗传病。近年来随着不孕不育症发病率不断升高，男性不育也逐渐成为全球最受关注的疾病之一。在人群中，大约有10%至15%育龄夫妇不能正常生育，其中大约有一半是男性不育所致。... 详细信息

男性不育是一种由遗传，环境，饮食等诸多因素引起的多基因遗传病。近年来随着不孕不育症发病率不断升高，男性不育也逐渐成为全球最受关注的疾病之一。在人群中，大约有10%至15%育龄夫妇不能正常生育，其中大约有一半是男性不育所致。调查研究表明，男性人群中大约有4%至5%的个体患有遗传因素所导致的男性不育。生精障碍是男性不育最为常见的病因之一，遗传因素在生精障碍的发生过程中起着重要作用。近年来，在生精障碍遗传病因的研究上取得了一定的进展，发现了一些与生精障碍相关的遗传因素，如染色体的畸形，Y染色体的微缺失以及某些基因的突变等。但这些因素只能解释部分的病例，仍有众多的生精障碍的遗传病因有待于进一步阐明。精子发生是一个复杂的过程，包括精原细胞的增殖分化、减数分裂、精细胞分化成精子等几个阶段。这个过程中有众多基因的参与，这些基因及其表达的异常都有可能导致生精障碍的发生。因此，这些参与生精过程的基因也被认为是生精障碍重要的候选基因，研究这些候选基因与生精障碍的关系，可为男性不育遗传病因、发病机制的最终阐明提供有价值的资料。 dnmt1(DNAmethyltransferase1)基因是近年来发现的一个生精障碍的重要候选基因，其编码产物dnmt1是一种DNA甲基化酶，该酶在DNA的甲基化过程中发挥重要作用。研究表明，精子发生过程中涉及众多基因的表达调控，而DNA甲基化是生精过程中基因表达调控的一种重要方式。某些基因的DNA甲基化是正常生精过程所必须的。在生精过程中，dnmt1基因在细胞增殖、减数分裂、精细胞分化等阶段和成熟的精子中均有表达，主要负责催化和维持染色体复制后的DNA甲基化状态,提示其在正常的生精过程中可能有重要作用。在小鼠中研究显示,dnmt1基因的异常表达,会导致生殖细胞凋亡和生精障碍。在一些生精障碍患者中也发现了dnmt1基因的表达异常。因此,dnmt1基因可能与人类生精障碍有关,其基因变异可能在生精障碍中发挥作用。近年来,一些信号转导系统与生精障碍的关系也逐渐受到关注。KIT/KITLG信号转导系统被认为是在生殖细胞正常发育调控中不可或缺的一个信号系统。KIT基因编码产物KIT受体是一种酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor), KITLG(KIT ligand)基因的产物是KIT受体的特异配体KITLG。该信号系统通过KIT受体与KITLG的特异性结合而激活。在实验动物中研究显示,KIT/KITLG信号转导系统的激活,对睾丸中生殖细胞的增殖、减数分裂、迁移、成熟等十分关键,在生精过程中发挥了重要作用。不同的动物模型研究表明,KIT或KITLG基因的异常,会导致生精障碍和雄性不育。这些研究结果提示,KIT和KITLG基因的变异也可能与人类生精障碍有关。目前,尚未有dnmt1基因、KIT基因和KITLG基因的变异与人类生精障碍的研究报道。有鉴于此,本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)和DNA测序等技术,在正常男性和无精症及少精症不育患者中,对dnmt1基因的SNP rs16999593,rs2228612, rs2228611, KIT基因的SNPrs3819392,以及KITLG基因的SNP rs995030, rs4474514的等位基因频率和基因型频率的分布进行了研究和分析,初步了解这三个基因的变异与生精障碍的关系,为今后进一步阐明这些基因在生精障碍发病过程中的机制提供一些参考依据。具体研究结如下： 1.通过比较病例组与正常对照组间dnmt1基因SNP rs16999593, rs2228612,rs2228611的等位基因频率和基因型频率的分布,发现SNP rs16999593和rs2228611的等位基因和基因型频率在少精症患者和正常对照组间存在显著性差异。SNP rs16999593的等位基因A(83.7%vs.77.6%, P=0.029, OR=1.47,95%CI=1.044-2.071)和基因型AA(69.1%vs.59%, P=0.027, OR=1.55,95%CI=1.045-2.314)以及SNP rs2228611的基因型AA(18.4%vs.9.9%,P=0.011,OR=2.05,95%CI=1.172-3.586)在少精症患者中显著高于正常对照组。这些结果表明,SNP rs16999593等位基因A和基因型AA,以及SNP rs2228611的基因型AA与少精症的发病风险相关,提示dnmt1基因的多态性可能影响少精症的发病易感性。 2.对KIT基因的SNP rs3819392, KITLG基因的SNP rs995030和rs4474514的等位基因频率和基因型频率分布的研究结果显示,KIT基因

关键词： dnmt1 KIT KITLG 单核苷酸多态性生精障碍

Lipofectamine2000降低HeLa细胞系中dnmt1的表达

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基础医学与临床 2018年第4期38卷 535-537页

作者：赵丹程易尘吴晓明罗瑛贾舒婷昆明理工大学医学院云南昆明650500

DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰，在基因的表达调控、基因组的稳定性和发育过程中都发挥着重要的作用［1］。DNA甲基化的维持由DNA甲基化转移酶家族成员DNA甲基转移酶1（dnmt1）催化完成。DNA甲基化水平的改变，通常与dnmt1密... 详细信息

DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰，在基因的表达调控、基因组的稳定性和发育过程中都发挥着重要的作用［1］。DNA甲基化的维持由DNA甲基化转移酶家族成员DNA甲基转移酶1（dnmt1）催化完成。DNA甲基化水平的改变，通常与dnmt1密切相关［3-4］。而Lipofectamine2000是一种常用的阳离子脂质体转染试剂，广泛地应用于特定基因的表达和敲低对细胞影响的研究。而阳离子脂质体对细胞有一定的毒性作用［5］。转染试剂Lipofectamine2000会影响细胞中dnmt1的表达，Lipofectamine2000对细胞的毒性作用可能是通过dnmt1实现的。因此本研究通对dnmt1在Lipofectamine2000处理Hela和395-9B-1（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞不同时间后的表达情况进行检测，并探讨Lipofectamine2000对细胞的毒性作用。

关键词： HeLa细胞系 dnmt1 DNA甲基化转移酶 DNA甲基转移酶1 小鼠胚胎成纤维细胞阳离子脂质体表观遗传修饰毒性作用

宫颈癌中dnmt1的高表达与其不良生存结局的相关性

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实用医学杂志 2018年第17期34卷 2921-2924页

作者：罗舒陈非郭黔文庆莲西南医科大学附属医院肿瘤科四川泸州646000

目的探讨dnmt1在宫颈癌中的表达与宫颈癌生存结局的相关性。方法以102例接受初级治疗的宫颈癌患者为研究对象,采用免疫组化检测dnmt1的表达,以dnmt1阳性细胞百分比及其强度表示dnmt1的表达程度,以Cox比例风险模型评估dnmt1的表达程度与... 详细信息

目的探讨dnmt1在宫颈癌中的表达与宫颈癌生存结局的相关性。方法以102例接受初级治疗的宫颈癌患者为研究对象,采用免疫组化检测dnmt1的表达,以dnmt1阳性细胞百分比及其强度表示dnmt1的表达程度,以Cox比例风险模型评估dnmt1的表达程度与调整相关协变量后存活率之间的关系。结果与正常宫颈组织及癌旁组织相比,宫颈癌组织中dnmt1的表达明显升高,dnmt1阳性细胞比例升高,dnmt1强度评分升高,并与生存率差异显着相关(P=0.041 1)。结论宫颈癌组织中DNMET1的表达较高,其高表达与宫颈癌的不良预后相关。

关键词：宫颈癌 dnmt1 生存结局

BMSC共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞dnmt1的影响

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中国细胞生物学学报 2019年第8期41卷 1517-1522页

作者：薛碧宇薛斌重庆医科大学附属第一医院烧伤整形外科

该实验探究人骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)能否通过旁分泌作用影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KF)中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, dnmt1)的表达,从而影响TGF-β/Smad信号通路。培养BMSC、KF及正常人皮肤成纤维细胞(normal human skin fibroblast, NHDF),使用0.4μm微孔孔径的悬挂式细胞培养皿构建BMSC与成纤维细胞之间非接触的细胞间接共培养模型。通过免疫荧光、激光共聚焦技术、Western blot和qPCR检测各组细胞内dnmt1的表达情况。Western blot和qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子TGF-β1、Smad7的表达。在成功构建共培养模型后,利用细胞免疫荧光和激光共聚焦技术, Western blot及qPCR检测各组细胞内dnmt1的表达情况,结果显示, dnmt1在KF中高表达而在NHDF中呈低表达,共培养组KF较非共培养组dnmt1的蛋白和m RNA水平表达明显降低(P1)。利用Western blot, qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子的表达,结果显示较非共培养组,共培养组KF中TGF-β1在蛋白水平表达显著降低(P1),抑制性蛋白Smad7在m RNA水平表达增高(Pdnmt1的表达,从而抑制TGF-β/Smad信号通路,使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖趋于正常。

关键词：骨髓间充质干细胞瘢痕疙瘩成纤维细胞共培养 dnmt1 TGF-β1

上调miR-148a表达对胰腺癌AsPC-1细胞dnmt1基因表达及细胞增殖和凋亡的影响

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上调miR-148a表达对胰腺癌AsPC-1细胞DNMT1基因表达及细胞增殖和...

作者：王福飞南昌大学

学位级别：硕士

目的：探讨上调microRNA-148a(miR-148a)表达对胰腺癌细胞系AsPC-1的DNA甲基转移酶1基因(dnmt1)表达及其增殖和凋亡的影响，为胰腺癌的基因治疗奠定一定的实验基础。方法：利用体外已构建好的miR-148a表达质粒pcDNA3.1/pri-miR-148a转... 详细信息

目的：探讨上调microRNA-148a(miR-148a)表达对胰腺癌细胞系AsPC-1的DNA甲基转移酶1基因(dnmt1)表达及其增殖和凋亡的影响，为胰腺癌的基因治疗奠定一定的实验基础。方法：利用体外已构建好的miR-148a表达质粒pcDNA3.1/pri-miR-148a转染胰腺癌AsPC-1细胞，建立稳定表达该质粒的细胞系。实验分三组：空白对照组（未转染），阴性对照组（转染pcDNA3.1），实验组（转染pcDNA3.1/pri-miR-148a）。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR)和Western Blot法分别检测转染前后AsPC-1细胞中dnmt1mRNA和蛋白表达的变化;MTT法检测细胞生长状况;利用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡的变化。结果：转染miRNA的表达质粒在胰腺癌AsPC-1细胞中稳定表达miR-148a后，与空白对照组和阴性对照组相比，实验组dnmt1mRNA相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组，差异具有统计学意义（0.3336±0.0839VS1.0016±0.0283VS1.0000±0.0000，均Pdnmt1蛋白表达明显下调，P1期的细胞比率高达72.5%，高于空白对照组和阴性对照组中AsPC-1细胞在G0/G1期的比率（分别为63.24%和63.42%）（p148a的质粒pcDNA3.1/pri-miR-148a转染胰腺癌AsPC-1细胞后能下调dnmt1基因mRNA和蛋白表达水平，并抑制该细胞的增殖，促进细胞凋亡。miR-148a有可能成为治疗胰腺癌的靶基因。

关键词： MicroRNA 胰腺癌 dnmt1 基因治疗细胞增殖细胞凋亡

SATB1和dnmt1在上皮性卵巢癌中的表达及相关研究

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SATB1和DNMT1在上皮性卵巢癌中的表达及相关研究

作者：高翔泰山医学院

学位级别：硕士

目的:本研究采用免疫组织化学染色SP技术,检测SATB1和dnmt1蛋白分子在不同卵巢组织上的表达含量,观察二者在正常卵巢组织、良性卵巢上皮性肿瘤组织和恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的差异性表达以及变化规律,分析SATB1蛋白和dnmt1蛋白在各组... 详细信息

目的:本研究采用免疫组织化学染色SP技术,检测SATB1和dnmt1蛋白分子在不同卵巢组织上的表达含量,观察二者在正常卵巢组织、良性卵巢上皮性肿瘤组织和恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的差异性表达以及变化规律,分析SATB1蛋白和dnmt1蛋白在各组织中的表达水平有无相关性,进一步揭示卵巢组织在恶变过程中SATB1蛋白和dnmt1蛋白可能发挥的作用机制。方法:本实验严格按照分组原则将80例卵巢上皮性肿瘤蜡块作为研究对象,对照组以10例正常组织蜡块作为参照,通过采用免疫组织化学染色SP技术测定SATB1和dnmt1蛋白在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和卵巢癌上的分布,分析它们在不同性质组织中的差异性,量化数据。应用SPSS软件对所得数据进行统计学处理,使用卡方检验及秩相关分析两者在卵巢上皮性恶性肿瘤组织中的差异表达情况以及对二者与卵巢癌的临床特征间的关系进行分析研究。结果:1、SATB1蛋白在9例正常卵巢组织、30例卵巢良性上皮性肿瘤及50例恶性肿瘤组织中的阳性表达分别占1例、10例、35例,阳性表达率依次为10%、33.3%和70.0%。卵巢恶性肿瘤组的阳性表达率高于其它两组,差异具有统计学意义(x=16.06,P0.05)。2、卵巢癌组织中SATB1蛋白的阳性表达与TNM分期具有相关性,SATB1蛋白在早期组和晚期组的表达率分别为45.5%和89.3%,两者比较差异有统计学意义(x=11.27,P1蛋白的表达程度与病理分级呈正相关,低级别组与高级别组卵巢癌组织标本之间SATB1蛋白表达情况比较差异具有显著性。低级别组SATB1蛋白表达强度低于高级别组(x=12.96,P1蛋白的表达率相比较无明显差异,无统计学意义(x=3.70,P>0.05);5、临床不同病理类型的卵巢癌患者的标本中,SATB1蛋白在各组中的表达率比较差异无统计学意义(x=1.79,P>0.05)6、术后病理显示在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组患者的标本中,SATB1蛋白在两者中的表达率比较差异无统计学意义(x=0.61,P>0.05)。7、SATB1蛋白在有腹水组和无腹水组的阳性表达率之间比较差异无统计学意义(x=0.52,P>0.05)。8、蛋白dnmt1在10例正常卵巢组织、30例卵巢良性上皮性肿瘤及50例恶性肿瘤组织中的阳性表达分别占1例、9例、30例,阳性表达率依次为10%、30%和60.0%。dnmt1蛋白在卵巢恶性上皮性肿瘤组中的阳性表达率明显高于另外两个对照组,差异有统计学意义(x=11.03,P1.60,P>0.05)。9、卵巢癌组织中dnmt1蛋白的阳性表达与TNM分期具有相关性,dnmt1蛋白在早期组和晚期组的表达率分别为36.4%和78.6%,两两比较差异有统计学意义(x=9.15,P10、dnmt1蛋白的表达程度与病理分级呈正相关,低级别组与高级别组卵巢癌组织标本之间dnmt1蛋白表达情况比较差异具有显著性。低级别组dnmt1蛋白表达强度低于高级别组(x=8.33,P11、不同年龄组卵巢癌患者的标本中dnmt1蛋白的表达率相比较无明显差异,无统计学意义(x=2.38,P>0.05);12、临床不同病理类型的卵巢癌患者的标本中,dnmt1蛋白在各组中的表达率比较差异无统计学意义(x=1.44,P>0.05)13、术后病理显示在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组患者的标本中,dnmt1蛋白在两组中的表达率比较差异无统计学意义(x=2.20,P>0.05)。14、dnmt1蛋白在有腹水组和无腹水组的阳性表达率之间比较差异无统计学意义(x=0.05,P>0.05)。15、SATB1蛋白和dnmt1蛋白的表达呈中度线性正相关关系(r=0.407 x=9.92P=0.002)。结论:1、SATB1和dnmt1的高表达与卵巢癌的发生息息相关,而且参与了卵巢癌的早期癌变过程,在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤和卵巢癌中呈现表达逐渐上调的特点,有望作为预测卵巢发生恶变的重要分子标志之一。2、SATB1和dnmt1的上调表达与卵巢癌的病理分级和临床分期进展有关,可能与卵巢癌的侵袭、浸润发生密切,可作为评估卵巢癌患者的病程变化程度,有望成为预测卵巢癌潜在的浸润趋势发展的生物靶点。3、卵巢癌患者的年龄与疾病的发生无显著相关,SATB1和dnmt1在不同年龄组的分布特点未发现有统计学差异。4、SATB1和dnmt1与有无淋巴结转移和有无腹水癌细胞无特异性相关关系,任意一组的阳性表达率均在较高水平,提示SATB1和dnmt1的异常分泌可以促进癌细胞的生长,未在淋巴结转移之前侵犯其他组织,可能与卵巢恶性肿瘤的其他转移和生

关键词： SATB1 dnmt1 卵巢上皮性肿瘤肿瘤标志物免疫组化

胃癌中caveolin-1、dnmt1蛋白和dnmt1 mRNA的表达及caveolin-1基因CpG岛甲基化状态检测

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胃癌中caveolin-1、Dnmt1蛋白和Dnmt1 mRNA的表达及caveolin-1基...

作者：顾立萍兰州大学

学位级别：硕士

目的研究正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中caveolin-1、dnmt1蛋白的表达及其二者表达的关系,并进一步检测了dnmt1 mRNA表达情况及caveolin-1基因启动子区域5’CpG岛甲基化状况,探讨caveolin-1、dnmt1基因与胃癌的发生发展及临... 详细信息

目的研究正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中caveolin-1、dnmt1蛋白的表达及其二者表达的关系,并进一步检测了dnmt1 mRNA表达情况及caveolin-1基因启动子区域5’CpG岛甲基化状况,探讨caveolin-1、dnmt1基因与胃癌的发生发展及临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学技术SP法检测了20例正常胃黏膜、40例不典型增生胃黏膜和70例胃癌组织中caveolin-1、dnmt1蛋白的表达;并用原位杂交技术检测了20例正常胃黏膜、40例不典型增生胃黏膜及60例胃癌组织中dnmt1基因mRNA的表达情况;应用MSP技术检测7例正常胃黏膜和37例胃癌组织中caveolin-1基因启动子区5’CpG岛甲基化状况,并同时运用免疫组化、原位杂交技术检测了caveolin-1蛋白、dnmt1蛋白及dnmt1 mRNA的表达状况。结果 1.正常胃黏膜腺上皮dnmt1蛋白阳性表达率为0%(除增生的小凹上皮、淋巴细胞可染色阳性),而70例胃癌组织中,dnmt1蛋白阳性表达率为70%(49/70)。dnmt1蛋白阳性表达率在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌各组间呈递增趋势,阳性表达率分别为0%(0/20)、35.0%(14/40)及70.0%(49/70),χ检验显示组间差异性有统计学意义(χ=34.710,P＜0.001)。dnmt1蛋白在高、中、低分化腺癌三组内的阳性表达率分别为60.0%(12/20)、82.4%(14/17)及67.9%(23/33),χ检验显示组间差异性无统计学意义(χ=2.189,P＞0.05)。caveolin-1蛋白在正常胃粘膜及不典型增生胃黏膜腺上皮细胞浆中为阳性表达,而在胃癌细胞浆中基本为阴性表达,其蛋白阳性表达率在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌各组间呈递减趋势,阳性表达率分别为90.0%(18/20)、82.5%(33/40)及28.6%(20/70),χ检验显示组间差异性有统计学意义(χ=41.806,P＜0.001)。caveolin-1蛋白在高、中、低分化腺癌三组内的阳性表达率分别为50.0%(10/20)、41.2%(7/17)及18.2%(6/33),χ检验显示组间差异性有统计学意义(χ=6.419,P＜0.05)。 2.经χ检验,在胃癌组织中dnmt1蛋白阳性表达率与性别、年龄、溃疡的大小、有无脉管转移和浸润深度等临床病理特征无关(P＞0.05),而与有无淋巴结转移有关(P＜0.05)。caveolin-1蛋白阳性表达率与性别、年龄无关(P＞0.05),而与有无淋巴结转移、浸润深度、有无脉管转移等临床病理特征有关(P＜0.05)。 3.Spearman等级相关分析显示dnmt1蛋白与caveolin-1蛋白表达呈负相关(r=-0.929,P＜0.05)。 4.dnmt1 mRNA在正常胃黏膜腺上皮中基本呈阴性表达(除部分增生的小凹上皮),在不典型增生胃黏膜、胃癌细胞胞浆中表达信号为阳性,其阳性表达率在三组间分别为0%(0/20)、25.0%(10/40)及63.3%(38/60),呈递增趋势,χ检验组间差异有统计学意义(χ=30.694,P＜0.001);dnmt1 mRNA阳性表达率在胃高、中、低分化腺癌三组间分别为50.0%(8/16)、58.8%(10/17)、74.0%(20/27),χ检验显示组间差异无统计学意义(χ=2.715,P＞0.05)。 5.Spearman等级相关分析显示dnmt1 mRNA和蛋白表达呈正相关(r=1.000,P＜0.01)。 6.胃癌标本中,caveolin-1基因启动子CpG岛区域甲基化发生率为73.3%(22/30),其中43.3%(13例)癌组织表现为完全甲基化;30.0%(9例)癌组织表现为部分甲基化。在7例正常胃黏膜中,caveolin-1蛋白表达均位于细胞浆内,dnmt1蛋白、mRNA基本不表达(除部分增生的小凹上皮;dnmt1蛋白也可在淋巴细胞中表达)。30例实验成功胃癌组织中,caveolin-1蛋白阳性表达率仅为30.0%(9/30),dnmt1蛋白阳性表达率为63.3%(19/30),dnmt1基因mRNA阳性表达率为53.3%(16/30)。 7.经Fisher精确概率法检验,caveolin-1基因启动子CpG岛区域甲基化发生率与性别、肿物大小、有无脉管侵犯、有无淋巴结转移和浸润深度等临床病理特征无关(P＞0.05),而与年龄有关(P＜0.05)。结论 1.dnmt1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率明显高于不典型增生及正常胃黏膜,dnmt1的高表达可在一定程度上反映胃癌的侵袭能力;而caveolin-1的表达趋势与其恰恰相反。联合检测dnmt1及caveolin-1蛋白在胃癌中的表达,有助于预估胃癌的浸润转移情况,可作为评价胃癌生物学行为的标志物。 2.胃癌组织中dnmt1 mRNA表达

关键词：胃癌 dnmt1 caveolin-1 免疫组织化学原位杂交甲基化特异性聚合酶链反应 CpG岛

胃癌组织中DAPK基因高甲基化与dnmt1表达的关系

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胃癌组织中DAPK基因高甲基化与DNMT1表达的关系

作者：高燕泰山医学院

学位级别：硕士

目的:探讨人胃癌组织DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)表达及其与死亡相关蛋白激酶((Death Associated Protein Kinase,DAPK)基因甲基化状态的关系。方法:收集80例胃癌组织及其相应的癌旁正常组织,胃癌组织均经手术切除... 详细信息

目的:探讨人胃癌组织DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)表达及其与死亡相关蛋白激酶((Death Associated Protein Kinase,DAPK)基因甲基化状态的关系。方法:收集80例胃癌组织及其相应的癌旁正常组织,胃癌组织均经手术切除且病理学证实,采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)方法检测胃癌组织及其相应癌旁组织DAPK基因甲基化状态,应用实时荧光定量逆转录-多聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法检测DAPK基因m RNA的表达,采用免疫组化SP法检测DAPK及dnmt1蛋白的表达水平。结果:80例胃癌组织48例发生了DAPK基因甲基化,甲基化阳性率为60%,其相应的癌旁正常组织有10例发生了DAPK基因甲基化,甲基化阳性率为12.5%,胃癌组织中DAPK基因甲基化阳性率显著高于其相应癌旁组织,差异有统计学意义(χ2=39.053,p1)。胃癌组织中DAPK基因甲基化状态与患者性别、年龄、肿瘤大小无关(p>0.05),而与肿瘤分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况有关(pdnmt1 m RNA阳性表达率为(68/80,85%),显著高于其相应癌旁正常组织(5/80,6.25%),而DAPK基因m RNA阳性表达率(20/80,25%)显著低于其相应癌旁正常组织(75/80,93.75%)。胃癌组织中DAPK蛋白的阳性表达率为12.5%(10/80),其相应癌旁组织DAPK蛋白的阳性表达率为97.5%(78/80),显著高于胃癌组织。胃癌组织中dnmt1蛋白阳性表达率为87.5%(70/80),显著高于其相应癌旁正常组织(8/80,10%)。48例发生了DAPK基因甲基化的胃癌患者,均表现出DAPK基因表达的缺失。胃癌组织中DAPK蛋白表达与dnmt1蛋白表达呈负相关(r=-0.391,p1)。结论:dnmt1基因高表达可能导致DAPK基因高甲基化,DAPK m RNA及蛋白表达减少,从而参与了胃癌的发生发展。

关键词：胃癌甲基化特异性PCR(MSP) DAPK dnmt1

dnmt抑制剂选择性机制的探究及dnmt1抑制剂的发现

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DNMT抑制剂选择性机制的探究及DNMT1抑制剂的发现

作者：谢天立浙江大学

学位级别：硕士

DNA甲基化是调节高等真核生物基因表达的一种表观遗传修饰,启动子CpG岛的过度甲基化会导致肿瘤抑制基因(TSGs)的失活,导致多种肿瘤的发生。由于甲基化过程是可逆的,研究者们很早就提出了DNA甲基转移酶(dnmts)可能成为药物治疗的理想靶点... 详细信息

DNA甲基化是调节高等真核生物基因表达的一种表观遗传修饰,启动子CpG岛的过度甲基化会导致肿瘤抑制基因(TSGs)的失活,导致多种肿瘤的发生。由于甲基化过程是可逆的,研究者们很早就提出了DNA甲基转移酶(dnmts)可能成为药物治疗的理想靶点,并希望通过药物使得DNA甲基化减少而降低TSGs启动子CpG岛的甲基化水平,从而达到治疗肿瘤的目的。近年来,尽管已经报道了多种非核苷类dnmt抑制剂,但由于它们存在抑制活性弱或特异性低的缺点,没有一种非核苷类dnmt抑制剂被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。鉴于高选择性和高活性的新型非核苷dnmt抑制剂存在迫切需求,本研究基于多种分子模拟方法研究了dnmt1和dnmt3A活性位点的差异,获得了与抑制剂选择性及抑制剂活性相关的结构信息,然后基于这些信息针对dnmt1进行基于靶标结构的药物设计,旨在得到高效且高选择性的dnmt1抑制剂。在本论文的第一部分中,通过分子动力学(MD)模拟、MM/GBSA(Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area)结合自由能计算等方法探究了三个小分子抑制剂(SFG,DC5和GSKex1)与dnmt1/3A的结合机理与选择性。结构分析与MM/GBSA结合自由能计算的结果可以与实验值很好的吻合。此外,MM/GBSA能量分解预测了对小分子结合起关键作用的重要残基,并表明非保守残基与小分子间的范德华相互作用是产生选择性的主要原因。dnmt1/3A中的Val1580/Trp893、Asn1578/Arg891和Met1169/Val665对dnmt抑制剂的选择性有显著影响,这部分影响反映在π-π堆积和氢键相互作用上。这部分研究为设计具有潜力的选择性dnmt抑制剂提供了重要的结构信息,是后续dnmt1抑制剂设计的理论铺垫。在本论文的第二部分中,采用基于分子对接的虚拟筛选方法对dnmt1进行了虚拟筛选。通过Glide和Autodock vina两种对接方法相结合的策略筛选了Chemdiv化合物库140多万个小分子,配合本论文第一部分的研究成果,根据与结合能相关的亲合性打分函数对蛋白和小分子化合物的结合力进行了评价,最终从中挑选出结合模式比较合理、预测得分较高的化合物,用于后续的生物活性评价。体外酶活实验的结果表明,i38系列的化合物对dnmt1有较好的活性,而在200μM浓度下对dnmt3A的抑制率几乎为0,其中活性最优化合物的IC为67μM,是目前文献报道中活性较好的dnmt1选择性抑制剂,有望成为治疗dnmt1相关癌症的先导化合物。同时i38系列化合物的发现也为dnmt1选择性抑制剂的设计与改造打下了基础。

关键词： dnmts dnmt1 选择性分子动力学模拟 MM/GBSA 虚拟筛选