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PM_(2.5)诱导BEAS2B细胞dnmt1下调激活Foxp3表达分子机制

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中国公共卫生 2018年第7期34卷 997-1000页

作者：凌晓璇张晓晴叶晓冰刘嘉贤温赛娴陈振发孔翠玉黄威黄诗荐岳振虎吴丽玉肖圆圆刘林华广东医科大学公共卫生学院实验教学中心广东东莞523808 广东医科大学医学检验学院东莞市环境医学重点实验室广东医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室

目的探讨PM_(2.5)激活人正常支气管上皮细胞(BEAS2B)Foxp3表达的分子机制。方法实验设对照组(磷酸盐缓冲液)、PM_(2.5)组(300μg/mL)、5-AzaC组(DNA甲基化转移酶抑制剂,5.0μmol/L)、TSA组(组蛋白去乙酰化酶抑制剂,0.2μmol/L)、PM_(2.5... 详细信息

目的探讨PM_(2.5)激活人正常支气管上皮细胞(BEAS2B)Foxp3表达的分子机制。方法实验设对照组(磷酸盐缓冲液)、PM_(2.5)组(300μg/mL)、5-AzaC组(DNA甲基化转移酶抑制剂,5.0μmol/L)、TSA组(组蛋白去乙酰化酶抑制剂,0.2μmol/L)、PM_(2.5)对照组;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测BEAS2B细胞中Foxp3、HOXA1和HOXA2基因表达,蛋白印迹法(Westerm blot)检测dnmts相关蛋白表达,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)检测DNA甲基化水平。结果与对照组比较,PM_(2.5)处理的BEAS2B细胞Foxp3表达量上升1.15倍,差异有统计学意义(Pdnmt1和dnmt3b表达量分别下降0.51和0.38倍,dnmt3a上升1.51倍,差异均有统计学意义(Pdnmt1蛋白表达降低,差异具有统计学意义(Pdnmt1表达激活Foxp3表达。

关键词： PM2.5 dnmt1 Foxp3 DNA甲基化人正常支气管上皮细胞(BEAS2B)

DAPK和dnmt1在宫颈癌中的相关性研究

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免疫学杂志 2009年第1期25卷 80-82,87页

作者：赵先兰孟志英乔玉环张会利饶燕玲郑州大学第一附属医院妇产科

目的探讨宫颈癌中DAPK(Death-associated protein kinase)启动子甲基化与dnmt1 mRNA的表达及两者之间的关系。方法应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术检测52例宫颈癌、60例CIN(cervical intraepithelial neoplasia)和20例正常宫颈组织中DAPK启动子甲基化状况;应用原位杂交方法检测dnmt1 mRNA的表达。结果正常宫颈鳞状上皮不存在DAPK基因启动子CpG岛甲基化,而在CIN和宫颈癌中的甲基化率分别为18.3%(11/60)、65.4%(34/52),差异有统计学意义(χ2=39.639,P1)。正常宫颈鳞状上皮、CIN和宫颈癌dnmt1 mRNA阳性率分别为10%、63.3%和78.8%,差异有统计学意义(χ2=29.057,P1)。DAPK异常甲基化和dnmt1 mRNA表达成正相关,r=0.308,P1。结论DAPK异常甲基化和dnmt1 mRNA过表达参与了宫颈癌的发生;DAPK基因启动子的甲基化过程可能是在dnmt1的催化作用下完成的。

关键词：宫颈癌抑癌基因甲基化 DAPK dnmt1

dnmt1基因shRNA慢病毒稳定转染KYSE150细胞株的建立及鉴定

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DNMT1基因shRNA慢病毒稳定转染KYSE150细胞株的建立及鉴定

作者：胡凯桂林医学院

学位级别：硕士

目的：构建人DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase1，dnmt1）的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体质粒，进行慢病毒包装并稳定转染食管癌细胞KYSE150。方法：将设计的基因片段合成所需的目的基因，并将目的基因插入... 详细信息

目的：构建人DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase1，dnmt1）的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体质粒，进行慢病毒包装并稳定转染食管癌细胞KYSE150。方法：将设计的基因片段合成所需的目的基因，并将目的基因插入慢病毒载体质粒plenti-U6上。plenti-U6-dnmt1重组质粒在293T细胞中进行慢病毒包装，用提取出来的病毒液感染KYSE150细胞。用杀稻瘟菌素对感染后的细胞进行筛选，并对筛选出的稳转细胞用RT-PCR、West blotting法进行鉴定。结果：plenti-U6-dnmt1成功转染的KYSE150细胞株，其dnmt1的mRNA和蛋白表达较转染前均有所下降。结论：成功重组了人dnmt1基因的慢病毒载体质粒，并用该质粒感染及筛选出稳定表达的KYSE150细胞株，为进一步研究dnmt1基因沉默后KYSE150细胞的形态、功能改变奠定了基础。

关键词：食管细胞食管癌 dnmt1 shRNA 慢病毒载体转染

dnmt1、3a和3b在神经母细胞瘤中的表达及临床意义

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DNMT1、3a和3b在神经母细胞瘤中的表达及临床意义

作者：郭芬天津医科大学

学位级别：硕士

目的：神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤之一,起源于胚胎期交感神经系统神经嵴细胞,具有恶性程度高、早期多处转移、易产生化疗耐药、复发率高等特点。由于其异质性的存在和复杂的影响因素,导致治疗困难,预后差,尤其是高危神经母... 详细信息

目的：神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤之一,起源于胚胎期交感神经系统神经嵴细胞,具有恶性程度高、早期多处转移、易产生化疗耐药、复发率高等特点。由于其异质性的存在和复杂的影响因素,导致治疗困难,预后差,尤其是高危神经母细胞瘤。近年来随着表观遗传学的发展,dnmts抑制剂已成功获得批准应用于血液系统疾病的临床治疗,在其他成人多种肿瘤中也开始了临床试验。然而其能否应用于儿童神经母细胞瘤的治疗,或与传统放化疗联合应用改善疗效,我们就应首先了解dnmts蛋白的表达情况。本研究的目的在于检测dnmts蛋白在神经母细胞瘤中的表达情况,初步探讨三种蛋白在神经母细胞瘤组织分化及侵袭进展中的作用,为dnmts抑制剂应用于神经母细胞瘤提供理论依据。方法：应用免疫组织化学染色的方法,检测dnmt1、3a和3b在43例神经母细胞瘤(neuroblastomas, NBs)和16例节细胞神经瘤(ganglioneuromas, GNs)中的表达情况。了解dnmt1、3a和3b蛋白表达与组织分化程度和临床分期的关系,明确在神经母细胞瘤中三种蛋白的表达与Ki-67表达的相关性,并初步探讨三种蛋白在神经母细胞瘤分化及侵袭进展中的作用。NBs中不同分期和分化程度之间及NBs与GNs之间dnmt1、3a和3b表达差异的比较采用Mann-Whitneytest。采用Spearman等级相关进行dnmt1、3a和3b的表达强度与Ki-67表达强度的相关性分析。应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析,均以双侧检验、p1.在43例神经母细胞瘤中,dnmt1、3a和3b的中位染色指数分别为41.0%、39.0%、41.0%。在16例节细胞神经瘤中,dnmt1、3a和3b的中位染色指数分别为19.0%、15.5%、12.0%。 2. dnmt3a在进展期NBs(Ⅲ、Ⅳ期)中的表达水平明显高于早期NBs(Ⅰ、Ⅱ期),差异具有统计学意义(pdnmt1和3b在不同临床分期间的表达无明显差异(p>0.05)。 3. dnmt1、3a在未/分化差的NBs中的表达水平明显高于分化中NBs,差异具有统计学意义(pdnmt3b在不同分化程度间的表达无显著性差异(p>0.05) 4. dnmt1、3a和3b在NBs中的表达水平均明显高于GNs中的表达,差异具有统计学意义(pdnmt1、3a和3b蛋白的表达水平与Ki-67的表达水平存在着明显的正相关,相关系数r值分别为0.563、0.572、0.408(p1.在神经母细胞瘤中,dnmt1、3a和3b蛋白的表达普遍存在。 2. dnmt1.3a和3b蛋白的高表达在神经母细胞瘤的发生发展和浸润侵袭(肿瘤细胞的分化程度和临床分期)中发挥着重要作用。 3.在神经母细胞瘤中dnmt1、3a和3b蛋白的表达与Ki-67标记指数存在着明显的正相关,可能影响肿瘤细胞的增殖过程。 4.依据dnmts在NBs中的普遍过表达及负向调控作用,我们推测dnmts可以成为NBs表观遗传学治疗的靶点,dnmts抑制剂有望用于神经母细胞瘤的治疗或与传统放化疗的联合治疗中。

关键词：神经母细胞瘤 dnmt1 dnmt3a dnmt3b Ki-67 dnmts 抑制剂

dnmt1和dnmt3b在唾液腺黏液表皮样癌中的表达及意义

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DNMT1和DNMT3b在唾液腺黏液表皮样癌中的表达及意义

作者：王星翱中国医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)是一种由腺上皮细胞构成的恶性肿瘤,是成人唾液腺恶性肿瘤中最常见的类型,20-40岁最为高发,女性多见,约占头颈部恶性肿瘤的3%。其临床表现多样,在口腔中,MEC多表现为固定的、橡... 详细信息

背景与目的:黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)是一种由腺上皮细胞构成的恶性肿瘤,是成人唾液腺恶性肿瘤中最常见的类型,20-40岁最为高发,女性多见,约占头颈部恶性肿瘤的3%。其临床表现多样,在口腔中,MEC多表现为固定的、橡胶状的无痛性肿块。最常见的症状是肿胀,其次是疼痛、溃疡和变色。低分化的MEC生长异常迅速,可发生局部淋巴结转移和肺、肝及骨的远处转移,经常导致患者面瘫,预后较差。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,dnmt)是DNA的甲基化被催化和维持中所必需的,其可以调节甲基化的过程。DNA甲基化是表观遗传现象的一个重要因素,在癌变过程中起着重要作用。多个研究表明,在各种癌症,如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤和口腔鳞状细胞癌等的发生中,均出现了dnmt的过表达。但在唾液腺MEC中,dnmt的表达尚未见报道。本研究采用免疫组织化学检测唾液腺MEC与正常唾液腺组织中dnmt1和dnmt3b的表达,探讨其与MEC患者临床病理参数的相关性。进而为涎腺黏液表皮样癌的研究找到新的研究发现,为早期诊断以及有针对性的预防和个体化治疗提供理论及临床基础。方法:采用免疫组织化学和Western blot来检测MEC标本43例,均取自于2010年1月至2013年9月间中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科手术切除唾液腺术后的标本,均经病理确诊,所有患者术前未进行放、化疗。对照组共17例正常唾液腺组织。dnmt1和dnmt3b1免疫组化结果采用SPSS22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化结果显示在唾液腺MEC中,dnmt1和dnmt3b在细胞质、细胞膜和细胞核内均有表达,但主要表达于细胞质和细胞膜中。其阳性表达率分别为37.21%和83.72%。在正常唾液腺组织中,dnmt1和dnmt3b阳性染色仅少量存在于样本腺泡导管上皮细胞,阳性表达率分别为17.65%和11.76%。对照组与MEC组dnmt1的的阳性表达率无明显差异,而dnmt3b的阳性表达率则差异显著(P1)。Western blot结果显示,MEC组织中dnmt1的表达相比于对照组升高,但无统计学差异;而dnmt3b的蛋白表达相比于对照组明显升高,其升高具有显著差异。结论:dnmt3b在黏液表皮样癌中的高表达,提示在黏液表皮样癌的发生中可能发挥重要作用。

关键词： dnmt1 dnmt3b 涎腺黏液表皮样癌免疫组化 Western blot

脂质体包裹dnmt1反义寡核苷酸诱导白血病细胞株孕酮受体去甲基化的实验研究

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第三军医大学学报 2003年第24期25卷 2212-2215页

作者：张晓兵刘泽军第三军医大学附属西南医院检验科重庆400038

目的　研究脂质体包裹DNA甲基转移酶 (dnmt1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体 (ProgesteroneReceptor,PR)启动子甲基化及表达的影响 ,探讨甲基化基因治疗的新途径。方法　人工合成的dnmt1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白... 详细信息

目的　研究脂质体包裹DNA甲基转移酶 (dnmt1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体 (ProgesteroneReceptor,PR)启动子甲基化及表达的影响 ,探讨甲基化基因治疗的新途径。方法　人工合成的dnmt1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白血病细胞株 ,用RT PCR检测dnmt1、PRBmRNA表达的变化以及用MSP分析PRA、PRB甲基化状态的改变。结果　用MG88转染白血病细胞株后 ,dnmt1mRNA显著下降 ;PRA、PRB启动子出现脱甲基化 ,PRBmRNA表达显著上升。结论　dnmt1反义寡核苷酸MG88可以诱导白血病细胞PR脱甲基化 ,使PRBmRNA表达升高 ,为DNA甲基化基因治疗的实验性研究提供了可能。

关键词： dnmt1 反义寡核苷酸白血病孕酮受体甲基化脂质体

Runx3、Rassf1a基因启动子在胃癌组织中的高甲基化及dnmt1的表达

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世界华人消化杂志 2012年第35期20卷 3457-3463页

作者：姜相君初蕾蕾崔艳欣宋明全解祥军田字彬青岛大学医学院附属青岛市市立医院消化内二科山东省青岛市266011 青岛大学医学院附属青岛市市立医院消化内一科山东省青岛市266011 青岛大学医学院附属医院消化内科山东省青岛市266003

目的:探讨人类相关转录因子3(human runt-related transcription factor 3,Runx3)、Ras相关区域家族1A(ras-association domain family 1a,Rassf1a)基因启动子区的甲基化和甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)基因的表达与胃癌发生的关系及临床意义.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(meth-ylation specific PCR,MSP)检测68例胃癌组织及其相应癌旁正常组织中Runx3、Rassf1a基因启动子区甲基化状态;同时应用实时荧光定量逆转录-多聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和免疫组织化学SP法分别检测基因的Runx3、Rassf1a、dnmt13个基因mRNA和蛋白的表达情况.结果:胃癌组织中Runx3、Rassf1a基因的甲基化阳性率较正常组织明显升高(45.59%vs10.29%;64.70%vs7.35%).胃癌组织中Runx3和Rassf1a mRNA阳性表达率明显低于正常组织(36.76%vs100%;27.94%vs97.06%),而胃癌组织中dnmt1 mRNA阳性表达率则明显高于正常组织(80.88%vs17.65%),差异均有统计学意义差异.胃癌组织与正常组织RUNX3、RASSF1a、dnmt1蛋白与mRNA表达基本相一致.Runx3 mRNA、Rassf1a mRNA阴性表达的胃癌组织中其基因启动子的甲基化率较阳性表达者明显升高(72.09%vs0;85.71%vs2.94%),差异具有统计学意义.胃癌组织中RUNX3、RASSF1a与dnmt1蛋白的表达均呈负相关(r=-0.627,P1;r=-0.477,P1).结论:Runx3、Rassf1a基因启动子区的高甲基化及dnmt1基因高表达可能与胃癌发生有关.

关键词：胃癌甲基化特异性PCR Runx3 Rassf1a dnmt1

miR-148a通过靶定dnmt1调节大鼠间充质干细胞向心肌细胞的分化

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武汉大学学报（医学版） 2019年第1期40卷 11-16页

作者：张文才宫俊龙杨帆赵洛沙郑州大学第一附属医院心血管内科

目的:探讨miR-148a对间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的调控作用。方法:将miR-148a及对照分别转染入大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),与新生大鼠心室心肌细胞(NRVMs)共培养,观察BMSCs的分化,通过增强及抑制miR-148a的表达水平观察miR-148... 详细信息

目的:探讨miR-148a对间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的调控作用。方法:将miR-148a及对照分别转染入大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),与新生大鼠心室心肌细胞(NRVMs)共培养,观察BMSCs的分化,通过增强及抑制miR-148a的表达水平观察miR-148a对BMSCs向心肌细胞分化的调控作用。运用荧光素酶报告实验、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹(WesternBlot)验证miR-148a靶向下调DNA甲基转移酶1(dnmt1)参与调节该过程。结果:过表达miR-148a有利于BMSCs向心肌细胞的分化,而当利用抑制剂下调miR-148a的表达,则阻止BMSCs向心肌细胞的分化。荧光素酶报告实验、qRT-PCR和WesternBlot实验发现miR-148a可以靶向下调dnmt1的表达,且dnmt1参与调节上述过程。结论:miR-148a通过靶向下调dnmt1促进MSCs向心肌细胞的分化过程。

关键词： miR-148a dnmt1 间充质干细胞分化心肌细胞

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dnmt1基因在小鼠胚胎发生阶段的转录

Dnmt1基因在小鼠胚胎发生阶段的转录

作者：黄晓萌中国农业大学

学位级别：硕士

正确的基因组印记(genomic imprinting)对哺乳动物个体的发育非常重要,而DNA甲基转移酶dnmtl是维持哺乳动物基因组印记最重要的酶。dnmtl基因转录的mRNA存在两种形式,即体细胞特异表达的dnmtls和卵母细胞特异表达的dnmtlo。前人曾经以... 详细信息

正确的基因组印记(genomic imprinting)对哺乳动物个体的发育非常重要,而DNA甲基转移酶dnmtl是维持哺乳动物基因组印记最重要的酶。dnmtl基因转录的mRNA存在两种形式,即体细胞特异表达的dnmtls和卵母细胞特异表达的dnmtlo。前人曾经以几十枚胚胎为模板,通过RT-PCR技术发现该基因在动物胚胎发育早期即开始表达。本论文在此基础上,以小鼠为材料,将模板量降至单枚卵母细胞或胚胎,在优化PCR的各种条件后,以期建立正常胚胎dnmtl基因的标准转录模式。实验同时分析了dnmtl与持家基因hprt的转录,结果发现,dnmtls的转录本不仅存在于卵母细胞(15h-post hCG)中,而且胚胎从原核到囊胚(118h-post hCG)的各个发育过程中,一直存在该类型的转录本,依次为卵母细胞100%(10/10)、原核甲期(20h-post hCG)30%(3/10)、原核晚期(30h-post hCG)20%(2/10)、2-C早期(35h-post hCG)70%(7/10),从2-C晚期(50h-post hCG)开始,包括4-C(65h-post hCG)、8-C(75h-post hCG)、桑椹胚阶段(93h-post hCG),直至囊胚阶段均为100%(10/10);而dnmtlo转录本仅存在于卵母细胞(100%,10/10)、原核早期(90%,9/10)和原核晚期(40%,4/10)胚胎中;hprt转录本在所检测的各阶段细胞或胚胎中均100%(10/10)存在。以10枚卵母细胞或胚胎为模板时发现,dnmtls转录本的量从卵母细胞到原核早期逐渐减少,这种低水平一直维持到原核晚期,从2-C早期开始有所回升,并在之后的发育过程中保持增加的趋势;而dnmtlo的转录本则仅存在于卵母细胞、原核早期和原核晚期的胚胎中,且水平呈下降趋势。结果表明卵母细胞中生成的dnmtls转录本在受精后迅速降解,胚胎基因组从2-c早期开始转录dnmtls;而卵母细胞中生成的dnmtlo mRNA在受精后以较慢的速度降解,胚胎基因组不再转录dnmtlo。本实验通过建立dnmtl在正常小鼠胚胎发生过程中的转录模式对不通过巢式PCR等特殊途径而检测微量模板的方法进行了有益的尝试,对于今后其他相关的检测或研究具有一定参考意义。

关键词：小鼠基因组印记 dnmt1 卵母细胞胚胎 RT-PCR