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miR-148a通过dnmt1调控MSCs向心肌分化的内在作用机制研究

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中国免疫学杂志 2017年第4期33卷 520-526,532页

作者：赖卓莉蒋昌科重庆医科大学附属永川医院儿科重庆402160

目的:验证DNA甲基转移酶1(dnmt1)是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向dnmt1调控骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌分化的作用机制。方法:MSCs细胞经5'-氮胞苷(5'-aza)诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的m... 详细信息

目的:验证DNA甲基转移酶1(dnmt1)是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向dnmt1调控骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌分化的作用机制。方法:MSCs细胞经5'-氮胞苷(5'-aza)诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的miRNAs。Targetscan软件分析异常表达的miR-148a的靶基因,将野生型或突变型dnmt1的3'-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(dnmt1-wt或dnmt1-mut)并分别与miR-148a mimics(miR-148a模拟物)或scramble(miR-148a阴性对照)共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因dnmt1,qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-638 mimics和scramble后,对dnmt1的mRNA和蛋白表达的影响。构建miR-148a慢病毒质粒,分别在转染到MSCs后的第1、7、14和28天后检测miR-148a对GATA结合因子4(Gata-4)基因上游DNA调控序列CpG甲基化水平的影响、qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-148a慢病毒质粒后对心肌特异蛋白:球蛋白重链(MHC)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表达的影响,以及对心肌特异转录因子心脏特异性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表达的影响。结果:miRNA芯片筛选5'-aza诱导MSCs向心肌分化后表达异常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表达明显上调。Targetscan、荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证dnmt1是miR-148a直接调控的靶基因。miR-148a慢病毒感染MSCs细胞,证实在转染的不同时间,Gata-4上游基因甲基化水平发生改变,且随着转染时间延长,Gata-4甲基化水平呈不断降低趋势,MSCs细胞内MHC和c Tn T表达提高,CD90和CD29表达降低,Nkx2.5和Gata-4表达提高,MSCs细胞出现向心肌分化。结论:miR-148a可通过靶向调控dnmt1而调控MSCs细胞的向心肌分化。

关键词： miR-148a dnmt1 骨髓间充质干细胞向心肌分化

dnmt1在不同年龄组人群角质形成细胞中的表达及意义

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重庆医科大学学报 2016年第10期41卷 1055-1059页

作者：刘朝东桂万里张恒术重庆医科大学附属第一医院整形外科重庆400016

目的：检测不同年龄组非曝光部位表皮组织的角质形成细胞中DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1,dnmt1）蛋白和m RNA的表达水平,初步探讨dnmt1在人表皮年龄衰老过程中的意义。方法：收集40例手术患者非曝光部位的表皮标本,根据... 详细信息

目的：检测不同年龄组非曝光部位表皮组织的角质形成细胞中DNA甲基化转移酶1（DNA methyltransferase 1,dnmt1）蛋白和m RNA的表达水平,初步探讨dnmt1在人表皮年龄衰老过程中的意义。方法：收集40例手术患者非曝光部位的表皮标本,根据年龄分为4组：儿童组（0～14岁）、青年组（15～39岁）、中年组（40～59岁）和老年组（60岁及以上）,用免疫组织化学、RTPCR及Western blot检测每例表皮组织中dnmt1蛋白和dnmt1 m RNA表达量,分析不同年龄组之间dnmt1表达水平的差异。结果：dnmt1主要表达于各组人表皮角质形成细胞的细胞核内,角质形成细胞dnmt1蛋白及m RNA表达依次在儿童组、青年组、中年组和老年组中呈下降趋势。儿童组、青年组、中年组和老年组角质形成细胞dnmt1阳性表达率分别为84.7%、69.4%、51.1%、12.3%,表达率得分分别为：23.10分、19.30分、14.40分和3.80分,采用LSD检验法对4组间进行两两比较,表明角质形成细胞dnmt1阳性表达率随年龄的增长呈递减趋势（均P〈0.05）。dnmt1 m RNA相对表达量为1.347、0.817、0.567和0.202,dnmt1蛋白的相对表达量为1.102、0.494、0.320和0.088,统计学分析dnmt1随着年龄的增长表达量降低（两两对比,均P〈0.05）。结论：随着年龄的增长,dnmt1的表达水平下降,推测人表皮衰老可能与dnmt1的表达下调有一定的关联。

关键词： dnmt1 表皮衰老角质形成细胞甲基化

利用dCas9-FokⅠ编辑大鼠dnmt1基因

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第7期32卷 841-848页

作者：张旭于磊陈炜高珊潘硕张连峰马元武中国医学科学院&北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型Fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas... 详细信息

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型Fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合,形成融合蛋白用于降低脱靶效应。FokⅠ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶,在本研究中,通过将FokⅠ功能结构融合到dCas9的N端,构建表达质粒p ST1374-dCas9-FokⅠ。我们前期研究中,发现一个sgRNA在介导Cas9编辑dnmt1基因建立条件敲除大鼠时,存在显著的脱靶现象。以此为基础,我们利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系统编辑大鼠dnmt1基因,研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-FokⅠmRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中,用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植,最终获得43只F0代大鼠,其中两只在靶点位置包含突变,突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析,结果显示,无脱靶现象存在。综上,表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因,并能显著提高特异性。尽管dCas9-FokⅠ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统,基因编辑效率有所下降,但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。

关键词： dnmt1 基因编辑大鼠 dCas9 FokⅠ 脱靶

TGF-β1经dnmt1调控肺癌A549细胞对顺铂的敏感性

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中国细胞生物学学报 2014年第11期36卷 1491-1496页

作者：李德涛吴艳凤薛成军侯玉磊陈辉重庆医科大学附属第一医院检验科重庆400016

转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)与肿瘤的发生、发展以及凋亡关系密切,DNA甲基化关键酶dnmts(DNA methyltransferases)在肿瘤发生及耐药中发挥重要作用,SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine)常因异常甲基化而表达下调。为探究肺癌对顺铂耐受的分子机制,该研究以肺腺癌A549细胞为研究对象,通过外源TGF-β1作用A549细胞,利用RT-PCR检测TGF-β1作用后dnmts和SPARC m RNA水平的变化以及A549细胞增殖能力和对顺铂敏感性的影响。结果显示:5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1作用24 h后,A549细胞dnmt1 m RNA表达均显著下调(P1、P1),SPARC m RNA表达均显著上调(P1、P1);5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1作用后的A549细胞对顺铂的IC50均显著低于对照组[(12.34±0.36)μmol/L、(10.93±0.69)μmol/L,对照组为(21.54±1.21)μmol/L;P1、P1];5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1作用后的A549细胞在顺铂环境中,其克隆数显著低于空白对照;15μmol/L顺铂作用24 h时,5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1组细胞凋亡分数均显著高于空白对照(P1)。结果提示:TGF-β1可下调A549细胞dnmt1的表达,进而上调抑癌基因SPARC并增加其对顺铂的敏感性,成功逆转肺腺癌A549细胞的恶性表型。该研究为进一步阐明肺癌对顺铂的耐受机制提供了新的思路。

关键词： TGF-β1 dnmt1 A549细胞顺铂

鞘内注射dnmt1-siRNA对CCI大鼠行为学和脊髓SOCS1、p-ERK、p-CREB表达的影响

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临床麻醉学杂志 2016年第9期32卷 919-922页

作者：张婷尹伟孙凯徐州市中心医院麻醉科 221002 徐州市中心医院疼痛科 221002 徐州医科大学附属医院疼痛科

目的：探讨 dnmt1在大鼠神经病理性痛中的作用及可能机制。方法清洁级健康雄性 SD 大鼠32只,体重200~250 g,随机分为四组：假手术组（S 组）、神经病理性痛组（CCI 组）、CCI＋dnmt1-siRNA 组（CDS 组）和 CCI＋control-siRNA 组（CCS ... 详细信息

目的：探讨 dnmt1在大鼠神经病理性痛中的作用及可能机制。方法清洁级健康雄性 SD 大鼠32只,体重200~250 g,随机分为四组：假手术组（S 组）、神经病理性痛组（CCI 组）、CCI＋dnmt1-siRNA 组（CDS 组）和 CCI＋control-siRNA 组（CCS 组）,每组8只。CDS 组在术后7、8、9 d 连续鞘内注射 dnmt1-siRNA（2μg/10μl）,CCS 组注射等体积的对照序列 siRNA（control-siRNA）。分别在术前1 d,术后3、5、7、9、12和14 d 测定大鼠的机械缩足阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）,术后14 d 测完行为学后处死大鼠,取 L4~L6脊髓腰膨大节段,采用 Western blot 技术检测脊髓 SOCS1、p-ERK、p-CREB 的表达水平。结果术后3、5、7、9、12和14 d CCI 组和 CCS 组大鼠的 MWT 明显低于,TWL 明显短于 S 组（P 〈0.05）；术后9、12、14 d CDS 组大鼠 MWT 明显高于,TWL 明显长于 CCS 组（P 〈0.05）；术后14 d CCI 组和 CCS 组 SOCS1表达明显低于 S 组和 CDS组,p-ERK、p-CREB 表达明显高于 S 组和 CDS 组（P 〈0.05）。结论鞘内注射 dnmt1-siRNA 明显抑制大鼠神经病理性痛,其机制可能与促进脊髓 SOCS1的表达,抑制 p-ERK、p-CREB 的表达有关。

关键词： dnmt1 SOCS1 p-ERK p-CREB 神经病理性痛脊髓

DNA hypomethylation promotes learning and memory recovery in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury

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Neural Regeneration Research 2023年第4期18卷 863-868页

作者： Guang Shi Juan Feng Ling-Yan Jian Xin-Yu Fan Department of Neurology Shengjing Hospital of China Medical UniversityShenyangLiaoning ProvinceChina Department of Neurology The People’s Hospital of Liaoning ProvinceShenyangLiaoning ProvinceChina Department of Pharmacy Shengjing Hospital of China Medical UniversityShenyangLiaoning ProvinceChina

Cerebral ischemia/reperfusion injury impairs learning and memory in patients.Studies have shown that synaptic function is involved in the formation and development of memory,and that DNA methylation plays a key role in the regulation of learning and memory.To investigate the role of DNA hypomethylation in cerebral ischemia/reperfusion injury,in this study,we established a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury by occlusion of the middle cerebral artery and then treated the rats with intraperitoneal 5-aza-2′-deoxycytidine,an inhibitor of DNA methylation.Our results showed that 5-aza-2′-deoxycytidine markedly improved the neurological function,and cognitive,social and spatial memory abilities,and dose-dependently increased the synaptic density and the expression of SYP and SHANK2 proteins in the hippocampus in a dose-dependent manner in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.The effects of 5-aza-2′-deoxycytidine were closely related to its reduction of genomic DNA methylation and DNA methylation at specific sites of the Syp and Shank2 genes in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.These findings suggest that inhibition of DNA methylation by 5-aza-2′-deoxycytidine promotes the recovery of learning and memory impairment in a rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury.These results provide theoretical evidence for stroke treatment using epigenetic methods.

关键词： cognitive memory DNA methylation dnmt1 hippocampus ischemia/reperfusion social memory spatial memory TET1 transient middle cerebral artery occlusion 5-aza-2′-deoxycytidine

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dnmt1影响猪卵巢颗粒细胞功能的研究

DNMT1影响猪卵巢颗粒细胞功能的研究

作者：何波华南农业大学

学位级别：硕士

卵泡是猪卵巢的基本结构和功能单位,其主要生理功能是排卵和分泌机体所需的性激素。在卵泡生长发育过程中,卵泡内的颗粒细胞过度凋亡会导致卵泡闭锁现象,进而影响母猪繁殖生产能力。DNA甲基化修饰是在甲基化转移酶dnmts的催化作用下,将... 详细信息

卵泡是猪卵巢的基本结构和功能单位,其主要生理功能是排卵和分泌机体所需的性激素。在卵泡生长发育过程中,卵泡内的颗粒细胞过度凋亡会导致卵泡闭锁现象,进而影响母猪繁殖生产能力。DNA甲基化修饰是在甲基化转移酶dnmts的催化作用下,将游离的甲基(CH)转移结合到DNA分子特定的碱基上,从而调控基因的转录表达。在哺乳动物中,dnmt1对催化DNA甲基化的形成起主要作用。为探索dnmt1对母猪颗粒细胞功能影响的机制,本研究首先利用dnmts的抑制剂5-Aza-CdR处理母猪卵巢颗粒细胞(Porcine granulosa cells,pGCs),然后采用qPCR、EdU、Annexin V-FITC、BSP等实验技术,研究抑制dnmt1基因转录表达对pGCs增殖、凋亡、周期、E2合成能力的影响,以及相关信号通路关键基因的mRNA表达量及DNA甲基化水平的变化。本研究主要结果如下:(1)抑制dnmt1表达能上调Caspase-3、Caspase-8、BAX、BAK、BIM和下调MCL-1基因mRNA表达水平,进而促进pGCs凋亡。(2)抑制dnmt1表达能下调PCNA、CDK1、CDK2、CCNA1、CCND1基因mRNA表达水平,进而抑制pGCs增殖及周期进程。(3)抑制dnmt1表达能下调CYP19A1、HSD17B1基因mRNA表达水平,进而抑制pGCs E2的合成分泌。(4)抑制dnmt1表达能下调凋亡信号通路基因Caspase-3、BAK和增殖及周期信号通路基因PCNA、CCNA1启动子序列的DNA甲基化水平。综合以上结果,本研究主要结论是:抑制dnmt1基因的转录表达可能降低Caspase-3和BAK基因启动子区域的DNA甲基化水平,上调Caspase-3和BAK基因mRNA的表达量,进而促进pGCs的凋亡;抑制dnmt1基因的转录表达可能下调PCNA和CCNA1基因启动子区域的DNA甲基化水平和下调PCNA、CDK1、CDK2、CCNA1、CCND1基因mRNA表达量,进而抑制pGCs增殖及周期进程;抑制dnmt1基因的转录表达可能下调CYP19A1、HSD17B1基因mRNA表达量,进而抑制pGCs E2的合成及分泌。这些研究结果将为进一步探索dnmt1调控卵巢颗粒细胞功能和卵泡发育的机制提供一定的理论参考。

关键词： DNA甲基化 dnmt1 卵巢卵泡猪颗粒细胞

dnmt1抑制MGMT表达调控下咽癌的作用机制

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DNMT1抑制MGMT表达调控下咽癌的作用机制

作者：吕亚运滨州医学院

学位级别：硕士

下咽癌占头颈部恶性肿瘤的5%左右,以低分化鳞状细胞癌为主,具有发病隐匿,恶性程度高,侵袭性强,预后差,易复发的特点。近年来,尽管以手术治疗为主的综合治疗策略不断优化,但5年生存率仍在40%左右。因此,寻找肿瘤发生、发展的重要因子并... 详细信息

下咽癌占头颈部恶性肿瘤的5%左右,以低分化鳞状细胞癌为主,具有发病隐匿,恶性程度高,侵袭性强,预后差,易复发的特点。近年来,尽管以手术治疗为主的综合治疗策略不断优化,但5年生存率仍在40%左右。因此,寻找肿瘤发生、发展的重要因子并探讨其作用机制,对下咽癌的诊治尤为重要。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,dnmts)介导的DNA甲基化作用是肿瘤发生、发展过程中重要的表遗传修饰,DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferase1,dnmt1)是复制后维持甲基化的关键酶,在多种类型肿瘤细胞中存在dnmt1的高表达。06-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(06-Methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)能够发挥DNA损伤修复酶的作用,它可独立参与DNA烷基化损伤修复,使DNA突变减少,在肿瘤的进程中起抑制作用,但其精确调控机制尚不清楚。有研究报道,dnmt1与抑癌基因启动子区CpG岛甲基化状态相关,通过抑制其转录,使抑癌基因失活,从而促进肿瘤的发生、发展,但dnmt1对MGMT表达调控作用的影响在下咽癌中尚未见相关报道。本研究检测了下咽癌组织中dnmt1、MGMT的表达情况,通过干扰下咽癌FaDu细胞系中dnmt1的表达,研究了 dnmt1对MGMT的表达及对下咽癌细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行初步探讨。目的:1.探究下咽癌组织中dnmt1、MGMT的表达情况及其与临床参数的相关性。2.探究dnmt1对下咽癌FaDu细胞MGMT表达及其基因启动子区甲基化状态的影响。3.初步探究dnmt1对下咽癌FaDu细胞凋亡的作用机制。方法:以32例下咽癌组织和20例正常鳞状上皮组织制作石蜡切片,利用免疫组化方法、实时定量PCR检测MGMT、dnmt蛋白及mRNA的表达情况,以下咽癌FaDu细胞系作为实验研究对象,制备并转染dnmt1 siRNA干扰下咽癌FaDu细胞dnmt1的表达,利用免疫荧光法、蛋白印迹法,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、Real-Time PCR检测干扰前后dnmt1、MGMT蛋白和mRNA的表达情况,MGMT基因启动子区甲基化状态的变化以及细胞早期凋亡情况。结果:1.dnmt1在下咽癌组织中高表达,免疫组化法检测dnmt1蛋白主要在下咽癌细胞核表达,少量表达在细胞质,与病理分级显著相关。2.MGMT在下咽癌组织中低表达,免疫组化法发现MGMT蛋白主要在正常鳞状上皮细胞质表达,少量表达在细胞核。3.通过Real-Time PCR检测,发现下咽癌组织中dnmt1 mRNA阳性表达率显著高于正常鳞状上皮组织,而MGMTmRNA阳性表达率显著低于正常鳞状上皮组织。4.下咽癌FaDu细胞经dnmt1 si RNA干扰后,dnmt1在蛋白和mRNA水平的表达均显著下调。5.降低dnmt1表达后,MGMT蛋白及mRNA的表达水平显著升高。6.降低dnmt1表达后,MGMT基因启动子区CpG岛部分去甲基化。7.降低dnmt1表达后,FaDu细胞早期细胞凋亡率显著提高。结论:1.dnmt1在下咽癌组织中高表达,其表达强度在不同病理分级中有显著差异。2.dnmt1通过调节MGMT基因启动子区CpG岛超甲基化,使其转录失活,导致MGMT蛋白表达减少,抑制下咽癌细胞凋亡,促进肿瘤的发生、发展。3.dnmt1在下咽癌的恶性行为中发挥重要作用,有可能成为下咽癌诊疗的新靶点。

关键词：下咽癌 dnmt1 MGMT 细胞调亡

siRNA沉默dnmt1对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

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肿瘤防治研究 2010年第9期37卷 1004-1009页

作者：魏钦俊鲁雅洁曹新南京医科大学生物技术系南京210029

目的靶向人dnmt1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法靶向dnmt1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-dnmt1,转染至乳腺癌细... 详细信息

目的靶向人dnmt1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法靶向dnmt1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-dnmt1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR法检测dnmt1mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR法分析沉默dnmt1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果在构建的靶向dnmt1的shRNA重组质粒pGCsi-dnmt1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调dnmt1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-dnmt1对乳腺癌MCF-7细胞中dnmt1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-dnmt1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论重组质粒pGCsi-dnmt1能特异有效地抑制MCF-7细胞内dnmt1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制dnmt1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示dnmt1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。

关键词： dnmt1 RNA干扰乳腺癌 MCF-7