检索结果-南通市图书馆

作者：杨阅楼青岛大学

学位级别：硕士

目的：探讨RUNX3、dnmt1在人胃癌组织中的表达,分析其与胃癌临床病理特征及Hp感染的关系。方法：取70例手术的胃癌及70例相应癌旁胃黏膜组织（距癌5cm以上）,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测RUNX3及dnmt1基因的mRNA水平,免疫组... 详细信息

目的：探讨RUNX3、dnmt1在人胃癌组织中的表达,分析其与胃癌临床病理特征及Hp感染的关系。方法：取70例手术的胃癌及70例相应癌旁胃黏膜组织（距癌5cm以上）,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测RUNX3及dnmt1基因的mRNA水平,免疫组化分别检测蛋白的表达水平。结果：胃癌组织中RUNX3的表达显著下调（0.5782±0.3470vs0.8062±0.4105）,dnmt1表达明显增高（1.7258±1.6361vs1.2015±0.3583）,RUNX3表达下调与肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。RUNX3下调的胃癌组织中dnmt1的表达明显高于RUNX3正常的组织（P＜0.05）,在HP阳性的胃癌组织中RUNX3的表达明显低于Hp阴性的胃癌组织（P＜0.05）。结论：RUNX3基因和dnmt1基因可能参与胃癌的发生发展,Hp感染在一定程度上参与RUNX3基因失活。

关键词： RUNX3 dnmt1 胃癌幽门螺秆菌

三阴性乳腺癌中EZH2及dnmt1的表达及其与抑癌基因甲基化的关系

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三阴性乳腺癌中EZH2及DNMT1的表达及其与抑癌基因甲基化的关系

作者：武萍萍南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancers TNBC)是指一种不表达雌激素受体(estrogen receptor ER)、孕激素受体(progestrone receptor PR)和人类表皮生长因子受体2亚型(human epithelial growth factor receptor 2 Her-2)的乳腺癌亚型。TNBC具有发病年龄较小、侵袭性强、恶性程度高、预后差等特点。由于其不表达ER, PR和Her-2往往较早发生侵袭和转移而且对内分泌治疗和抗Her-2的靶向治疗效果差,其治疗手段相对于其他乳腺癌亦相应受到限制。抑癌基因启动子区CpG异常甲基化在多种肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件,也是肿瘤发生的一个早期敏感指标。在基因甲基化过程中,EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)能够通过募集DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferasel, dnmt1)催化抑癌基因发生异常甲基化,从而沉默抑癌基因的表达,并能促进多种恶性肿瘤转移。本课题旨在探索TNBC中EZH2、dnmt1表达之间的联系及与三阴性乳腺癌临床病理参数之间的关系,并探究EZH2及dnmt1表达与抑癌基因甲基化间的相互关系。对TNBC发病机制提供进一步的认识,为其预防治疗以及预后的判断提供更可靠的依据。目的通过检测131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌及65例癌旁组织中EZH2及dnmt1蛋白的表达情况,探讨EZH2及dnmt1蛋白的表达特点及与三阴性乳腺癌主要临床病理参数的关系。方法收集、筛选广州金域医学检验中心2008年1月至2013年5月乳腺癌病理资料较齐全的石蜡包埋标本209例(131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌),癌旁乳腺组织65例(距离肿瘤边缘4cm以上)。采集患者年龄、是否绝经、肿瘤病理类型、组织学级别、肿瘤大小、有无淋巴结转移、有无脉管神经浸润等资料。采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase SP)法,检测131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌及65例癌旁组织中EZH2及dnmt1的蛋白表达情况。运用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采用χ2检验对计数资料进行分析比较,采用多因素Logistic回归分析EZH2及dnmt1阳性表达有关的因素,Spearman等级相关分析三阴性乳腺癌中EZH2及dnmt1表达的相关性。结果EZH2蛋白在三阴性、非三阴性乳腺癌组织和癌旁组织的阳性表达率分别为86.3%、89.7%和40.0%;dnmt1蛋白在三种组织中的阳性表达率分别为63.4%、66.6%和44.6%;两种蛋白在乳腺癌组织中的表达均高于癌旁组织差异具有统计学意义(Pdnmt1的表达与肿瘤分级和淋巴结转移有关(Pdnmt1表达与肿瘤组织学分级有关(p1),随着组织分级升高,EZH2及dnmt1表达也升高。结论EZH2及dnmt1蛋白均参与了TNBC的进展及转移,联合检测二者的表达可能对TNBC的预后判断具有潜在的价值。目的检测TNBC组织中抑癌基因14-3-3sigma、RASSF1A、CDH1、P16、 ERa启动子甲基化状态。分析它们与三阴性乳腺癌临床病理参数的关系,从而探讨抑癌基因甲基化在TNBC中的临床意义。方法运用甲基化特异性PCR (methylation-specific polymerase chain reaction, MSP)分别对119例TNBC组织和58例癌旁组织P16、CDH11、RASSF1A、 14-3-3 sigma、ER3、ER4、ER5启动子区甲基化状况进行检测。结果14-3-3sigma基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为71.4%、29.3%(P1%、19.1%(P1基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为37.8%、16.1%(P16基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为40.3%、23.5%(P1.4%(P14-3-3 sigma基因甲基化与组织学分级、肿瘤类型、淋巴结转移相关,浸润性导管癌中14-3-3 sigma基因甲基化率明显高于其他组织类型,G3组14-3-3sigma基因甲基化率高于G1、G2组,淋巴结转移组14-3-3sigma基因甲基化率高于未发生淋巴结转移组,组间差异具有统计学意义(P1A基因甲基

关键词：三阴性乳腺癌非三阴性乳腺癌 EZH2 dnmt1 免疫组织化学甲基化抑癌基因甲基化特异性PCR

瘢痕疙瘩成纤维细胞dnmt1的表达及5-氮杂-2-脱氧胞苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响

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瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的表达及5-氮杂-2-脱氧胞苷对瘢痕疙瘩成...

作者：杨娥重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分：瘢痕疙瘩成纤维细胞dnmt1的表达及意义背景与目的：瘢痕疙瘩是整形烧伤外科常见的疾病之一,其发病机制与成纤维细胞的过度增生及胶原的大量无序沉积有关，其确切机制尚不完全清楚。DNA的甲基化与众多增生性疾病及纤维化性疾... 详细信息

第一部分：瘢痕疙瘩成纤维细胞dnmt1的表达及意义背景与目的：瘢痕疙瘩是整形烧伤外科常见的疾病之一,其发病机制与成纤维细胞的过度增生及胶原的大量无序沉积有关，其确切机制尚不完全清楚。DNA的甲基化与众多增生性疾病及纤维化性疾病的发病存在密切的联系，而瘢痕疙瘩的发病是否与DNA甲基化有关，瘢痕疙瘩甲基化相关因子的表达如何目前尚未见报道，因此，我们从表观遗传学的角度去探讨瘢痕疙瘩发生的另一种可能的机制-DNA甲基化，并且可能为瘢痕疙瘩的防治提供新的靶点与切入点。方法：收集53例瘢痕疙瘩患者手术切取的瘢痕疙瘩及其周围正常皮肤标本，并按生长期分为A（12个月）、C（1～2年）、D（>2年）4组;使用免疫组织化学法检测，比较各组标本正常皮肤、浸润部、增生部及老化部成纤维细胞dnmt1的表达差异;RT-PCR法检测各组标本及不同部位成纤维细胞dnmt1mRNA的表达。结果：dnmt1在成纤维细胞中主要分布于胞核内;瘢痕疙瘩成纤维细胞dnmt1蛋白阳性表达率及dnmt1mRNA表达均高于正常皮肤成纤维细胞（P=0.001）;瘢痕疙瘩生长期较短组成纤维细胞dnmt1阳性表达率及dnmt1mRNA表达均高于生长期较长组（P=0.007）;位于瘢痕疙瘩浸润部的成纤维细胞dnmt1阳性表达率及dnmt1mRNA表达均高于增生部与老化部（P=0.001）。结论：dnmt1在瘢痕疙瘩发病中具有重要作用;随着瘢痕疙瘩生长期的延长，dnmt1的表达有降低趋势;随着瘢痕疙瘩中部成纤维细胞老化，dnmt1表达降低。提示dnmt1在瘢痕疙瘩生长过程中起着重要的作用，并且与瘢痕疙瘩浸润生长密切相关。第二部分瘢痕疙瘩成纤维细胞系的建立及生长特性研究目的：通过实验条件的摸索构建瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代培养方法，观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态特征，初步研究瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长特性，培养足够的瘢痕疙瘩成纤维细胞为后阶段实验奠定坚实的基础。方法：采用单细胞法原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞并传代培养，摸索瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的最佳环境及培养方法，在显微镜下观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长形态，采用MTT法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线。结果：原代培养后，约第3天可见瘢痕疙瘩成纤维细胞贴壁生长，传代时间在第15天左右;瘢痕疙瘩成纤维细胞形态如同梭形或星形，呈现漩涡状或者放射状的排列方式，MTT法测瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线呈“S”型，瘢痕疙瘩成纤维细胞生长状态良好，可作为下一步实验的资源。结论：瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代及传代培养过程顺利，细胞生长状态好，我们已成功构建瘢痕疙瘩原代及传代培养的整个体系，为我们下阶段的实验研究提供了保证。第三部分5-氮杂-2-脱氧胞苷对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞生长周期及凋亡的影响背景与目的：近年来，对瘢痕疙瘩的发病机制及防治的研究越来越热，然而对于瘢痕疙瘩的防治仍是整形烧伤外科的一大难题，第一部分我们已经证实瘢痕疙瘩成纤维细胞存在dnmt1的高表达，因此，表观遗传学中的DNA甲基化的研究在瘢痕疙瘩的防治中可能有积极意义。本实验拟探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞生长周期及凋亡的影响，进一步探讨瘢痕疙瘩与DNA甲基化的关系及寻找瘢痕疙瘩的治疗方法。方法：原代培养人体瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞。使用甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷干预体外培养的瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞，通过流式细胞技术检测细胞在干预前后细胞生长周期及凋亡的变化情况。结果：在同等条件下，瘢痕疙瘩成纤维细胞生长周期位于G0/G1期细胞数（P=0.035）及细胞凋亡数（P=0.006）较正常皮肤成纤维细胞低;5-氮杂-2-脱氧胞苷干预人瘢痕疙瘩成纤维细胞后，瘢痕疙瘩成纤维细胞停滞于G0/G1期比例增加（P=0.000），并且细胞凋亡率增加（P=0.047），而正常皮肤成纤维细胞组均无明显变化（P均>0.05）。结论：甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可将体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞阻滞于G0/G1期，并且诱导细胞凋亡，进一步证明了瘢痕疙瘩的发生与基因的甲基化密切相关，甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可能成为瘢痕疙瘩防治的新选择。第四部分5-氮杂-2-脱氧胞苷对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子的影响背景与目的：前述研究发现瘢痕疙瘩的发生与DNA甲基化存在密切联系，并且甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可抑制体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长并诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡。因此，我们将进一步探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子dnmt1、TGF-β1mRNA、Smad7mRNA的作用。方法：常规原代及传代培养人瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细

关键词：瘢痕疙瘩成纤维细胞 dnmt1 5-氮杂-2-脱氧胞苷

银屑病皮损NF-κB，IL-6，p16，dnmt1和HDAC1表达及共表达研究

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银屑病皮损NF-κB，IL-6，p16，DNMT1和HDAC1表达及共表达研究

作者：邵依郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的银屑病是一种常见并且容易复发的慢性炎症性皮肤病,有表皮过度增生和血管增殖。银屑病的发病机制复杂,病因未明确,是当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。目前国内外多认为,银屑病是具有遗传易感基因的个体在内外界环境因素... 详细信息

背景和目的银屑病是一种常见并且容易复发的慢性炎症性皮肤病,有表皮过度增生和血管增殖。银屑病的发病机制复杂,病因未明确,是当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。目前国内外多认为,银屑病是具有遗传易感基因的个体在内外界环境因素作用下,T细胞介导的炎症性皮肤病。NF-κB (nuclear factor-κB)是一种真核细胞转录因子,位于活化的T细胞信号转导通路末端,是重要的桥梁,紧密连接被活化的T细胞和银屑病相关炎症介质的转录。IL-6是一种重要的炎症介质,能通过对内皮细胞的影响参与炎症反应,可引起自身抗原提呈异常而触发自身免疫反应,可促进角质形成细胞及T细胞增殖和活化,且和银屑病的严重程度相关。P16基因是一种抑癌基因,主要参与细胞周期调控,在细胞增殖负性调节中起重要作用。已有报道表明,表观遗传调控机制在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展中起到重要作用。已有研究表明表观遗传调控参与了银屑病的发病机制,但表观遗传调控在银屑病的发病机制中的作用尚未十分明确。表观遗传调控是指在DNA序列没有发生变化的情况下,基因的异常表达调控了可遗传的变化,包括细胞的生长、分化、增殖以及凋亡。表观遗传调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA调控。DNA甲基化是最早发现的表观遗传的修饰途径之一,能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA和蛋白质相互作用方式的变化,从而调节和控制基因表达。DNA甲基化可以沉默某些基因的表达,而低甲基化则能够诱导某些基因的表达。现在国内外已有报道发现大量肿瘤抑制基因失活与该基因启动子区域的过度甲基化有密切的直接联系。与此相反,低甲基化会导致某些在正常状态下受到抑制的基因如癌基因过度表达,从而导致癌症的发生。参与DNA甲基化重要的酶就是DNA甲基化修饰酶dnmts。组蛋白修饰是另一种重要的表观遗传调控机制。组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质,包括H1、H2A、H2B、H3、H4共5种。其中除H1外,其余4种组蛋白均以二聚体相结合,共八聚体,组成核小体核心,DNA围绕在核小体的核心,H1与核小体间的DNA结合。核小体是构成染色质的基本单位。组蛋白翻译完成后,八聚体的氨基N末端富含疏水氨基酸,能够发生多种共价修饰。这些共价修饰可以相互联合或者被其他的蛋白酶或复合体等识别和结合,进而发挥作用,为促进或抑制基因表达的染色质相关蛋白提供可结合的位点。目前研究较多的组蛋白修饰是组蛋白乙酰化。组蛋白乙酰化与基因的活化、DNA复制相关,而组蛋白去乙酰化和基因的失活相关。组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HATs)将乙酰基转运至组蛋白H3、H4的氨基N末端,而组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)有着恰恰相反的作用。MicroRNA是最近几年在真核生物中发现的一种参与基因转录后调控的非编码小分子RNA。它通过与目的靶mRNA的碱基序列的配对,进而导致目的基因翻译的抑制和基因表达的沉默。在此基础上探讨银屑病皮损的NF-κBJL-6, P16的表达水平及各与dnmt1或HDAC1的共表达的关系。材料与方法1.临床资料收集我院2011年2月至2011年8月皮肤科门诊寻常型银屑病患者30例,均经组织病理学确诊。其中男22例,女8例,年龄15-49岁,平均年龄(29.21±14.93)岁,病程(11.25±6.21)年,PASI评分为(28.68±14.52)分。有家族史的12例。收集我院2011年7月至8月泌尿外科包皮切除术患者30例,年龄22岁-38岁,平均年龄(31.91±6.24)岁。本研究经我院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。2.标本的处理所有标本均置于4%多聚甲醛固定,常规制备为石蜡包埋的切片。标本在脱蜡入水过程中,分别进行以5mmol/L左旋咪唑/95%乙醇,处理20min消除内源性碱性磷酸酶,以3%H202/D.H20处理20min以消除内源性过氧化物酶。应用NF-κB鼠单抗,,IL-6鼠单抗,p16鼠单抗,dnmt1兔多抗和HDAC1羊多抗对皮损和正常组织进行NF-κB, IL-6,P16以AEC为底物的免疫组化单染色,和HDAC1或dnmt1以NBT-BCIP为底物的免疫组化的单染色。dnmt1或HDAC1分别与NF-κB,IL-6,P16的免疫组化的双染色。皮损和正常组织标本同时以正常血清封闭后,分别用PBS以1：100稀释的单抗及多抗混合4℃孵育过夜,先进行单抗的AEC染色后,再进行多抗的NBT-BCIP染色,水洗,终止反应。同时进行以PBS代替一抗的阴性对照。采用免疫组化法检测30例寻常性银屑病和30例包皮环切术皮损中NF-κB, IL-6,P16及各与dnmt1或HDAC1的表达和共表达,并利用计

关键词： NF-κB IL-6 P16 dnmt1 HDAC1 寻常性银屑病

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低温压力下斑马鱼dnmt1基因的作用研究

低温压力下斑马鱼dnmt1基因的作用研究

作者：王琼上海海洋大学

学位级别：硕士

鱼类作为变温动物,其体温会受到周围水温的影响,环境温度可以通过影响鱼类的体温来调节其生长与发育等。低温会对鱼类的生长、发育、代谢、免疫等造成巨大影响,严重时甚至会导致死亡。虽然目前全球变暖,但是每年仍然有寒潮发生,每次寒... 详细信息

鱼类作为变温动物,其体温会受到周围水温的影响,环境温度可以通过影响鱼类的体温来调节其生长与发育等。低温会对鱼类的生长、发育、代谢、免疫等造成巨大影响,严重时甚至会导致死亡。虽然目前全球变暖,但是每年仍然有寒潮发生,每次寒潮都会造成大面积的鱼死亡,对环境和经济都造成了极大的影响。因此研究低温压力对鱼类的生理影响及分子调控机制具有重要意义。表观遗传修饰对动植物适应低温压力具有重要作用,特别是DNA甲基化,DNA甲基化参与了很多植物在低温压力下基因的表达调控,但是关于DNA甲基化在鱼类低温适应过程中的作用研究却并不多。DNA甲基化是指一个甲基基团通过DNA甲基转移酶结合到基因组Cp G二核苷酸的胞嘧啶上,从而影响DNA和转录因子的可及性、促进或抑制转录的发生。DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,dnmt)蛋白家族调控。dnmt蛋白家族包括dnmt1、dnmt2、dnmt3A、dnmt3B和dnmt3L,其中dnmt1在调控DNA甲基化过程中占据主导作用。dnmt1可以通过调节基因的甲基化水平来促进或者抑制基因的转录从而来决定基因是否可以正常表达。斑马鱼(Danio rerio)是一种使用广泛的模式生物,其遗传背景明确、繁殖快。斑马鱼的最适生长温度为28.5℃,其自然生存的温度范围为16-40℃,是研究温度适应的良好材料。本实验室前期检测低温下斑马鱼胚胎成纤维细胞(zebrafish embryonic fibroblast like cell line,ZF4)的全基因组DNA甲基化水平,发现短期低温(18℃,5d)压力下甲基化水平升高、长期低温(18℃,30d)压力下甲基化水平降低,并发现DNA甲基化水平显著变化的区域大多数集中在与鱼类冷适应相关的基因启动子这一块,表明DNA甲基化在鱼类低温适应的过程中发挥了重要作用。但是DNA甲基化的上游调控机制以及在低温压力下的作用仍不明确。本研究通过RT-q PCR检测低温压力下斑马鱼ZF4细胞中dnmt1的表达水平,然后在低温条件下过表达和敲降ZF4细胞中的dnmt1,检测dnmt1的表达情况并分析dnmt1基因在鱼类低温适应过程中的调控机制。本研究对生长状态良好的斑马鱼ZF4细胞进行低温处理(18℃处理1天,2天,3天,4天,5天),RT-q PCR检测低温压力下ZF4细胞中dnmt1的m RNA表达量。克隆斑马鱼dnmt1的CDS区并构建pc DNA3.1-FLAG-dnmt1过表达质粒,将pc DNA3.1-FLAG-dnmt1过表达质粒(FLAG-dnmt1)转染至ZF4细胞以过表达dnmt1。构建p LKO.1-negative control-sh RNA(sh-nc)和p LKO.1-dnmt1-sh RNA(sh-dnmt1)敲降质粒,通过慢病毒包装后感染斑马鱼ZF4细胞以敲降dnmt1。将dnmt1过表达细胞和dnmt1敲降细胞经18℃低温处理3天,ELISA检测全基因组DNA甲基化水平,台盼蓝染色法检测细胞存活率,RT-q PCR检测细胞内凋亡相关基因bax、bcl-2、caspase-3的表达情况。结果如下:1.低温压力下,斑马鱼细胞ZF4中dnmt1的m RNA表达水平升高;2.低温压力下,与阴性对照组(control)相比,FLAG-dnmt1过表达组中斑马鱼ZF4细胞的全基因组DNA甲基化水平显著升高、细胞存活率显著降低,细胞凋亡相关基因bax和caspase-3的表达量显著上调、bcl-2的表达量显著下调;3.低温压力下,与sh-nc组相比,sh-dnmt1敲降组中斑马鱼ZF4细胞的全基因组DNA甲基化水平显著降低、细胞存活率显著升高,细胞凋亡相关基因bax和caspase-3的表达量显著下调、bcl-2的表达量显著上调。综上所述,本研究表明低温压力下斑马鱼dnmt1可能会通过调节DNA甲基化水平来调控细胞凋亡,参与低温响应生物过程,为后期研究斑马鱼适应低温压力的分子机制提供新线索。

关键词：低温 ZF4细胞 dnmt1 DNA甲基化细胞凋亡

非小细胞肺癌的表观遗传学治疗对dnmt1表达的影响

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非小细胞肺癌的表观遗传学治疗对DNMT1表达的影响

作者：栾加强桂林医学院

学位级别：硕士

目的：探讨表观治疗对非小细胞非小细胞肺癌(NSCLC) dnmt1表达的影响特点及生物学作用。方法：本研究分为两部分。第一部分：表观治疗对NSCLC中dnmt1的影响及作用机制的研究：1.表观治疗对NSCLC中dnmt1表达的影响。非小细胞肺癌细胞分... 详细信息

目的：探讨表观治疗对非小细胞非小细胞肺癌(NSCLC) dnmt1表达的影响特点及生物学作用。方法：本研究分为两部分。第一部分：表观治疗对NSCLC中dnmt1的影响及作用机制的研究：1.表观治疗对NSCLC中dnmt1表达的影响。非小细胞肺癌细胞分为对照组(未用药)、5-AZA-CDR治疗组(1～3天)、MS-275治疗组(第4天)及混合治疗组(第1-3天,5-AZA-CDR;第4天,MS-275),治疗后收集细胞,提取蛋白通过Western blotting技术对dnmt1表达进行分析;2.表观治疗抑制dnmt1表达的作用机制,按照第一部分治疗方案收集细胞样本,提取总RNA,进行逆转录合成cDNA,然后进行qRT-PCR分析。第二部分：表观治疗的用药浓度及治疗后非小细胞肺癌细胞中dnmt1变化的研究。1.表观治疗药物治疗NSCLC的最佳用药浓度的探究：对非小细胞肺癌细胞分为对照组(未用药)、5-AZA-CDR治疗组(1-3天)、MS-275治疗组(第4天)及混合治疗组(第1～3天,5-AZA-CDR;第4天,MS-275),加入不同浓度的药物,通过MTT及Western blotting技术探索治疗非小细胞肺癌细胞的最佳用药浓度;2.表观治疗结束后非小细胞肺癌细胞中dnmt1表达的变化。表观治疗后,收集停药后不同时间段的非小细胞肺癌细胞,进行Western blotting分析,来检测停药后dnmt1在非小细胞肺癌细胞中表达的变化。结果：第一部分：1.表观治疗后,治疗组dnmt1表达水平均低于未治疗组,联合治疗组较5-AZA-CDR治疗组有效,而5-AZA-CDR治疗组比MS-275治疗组效果明显;2.通过qRT-PCR研究证明了dnmt1生成减少是其在细胞中表达降低的主要原因。第二部分研究发现,表观治疗药物如果药物浓度过小对dnmt1抑制效果不明显,若用量过大则会产生细胞毒性;表观治疗结束时对非小细胞肺癌细胞中dnmt1的抑制作用最强,但随着停药时间的延长,dnmt1表达水平有所恢复;而且不同细胞株对表观治疗的敏感性不同。结论1.表观治疗能有效抑制NSCLC中)NMT1基因的表达,而且对NSCLC生长有抑制作用,并能诱导其死亡。DNA甲基化转移酶抑制剂5-AZA-CDR对dnmt1的抑制作用较去乙酰化酶抑制剂MS-275直接有效,联合用药效果更佳。表观药物对dnmt1的抑制作用主要体现在阻碍其生成。2.表观治疗药物如果药物浓度过小对抑制dnmt1效果不明显,若用量过大则会产生细胞毒性,而且不同细胞株对表观药物的敏感性不同。3.表观治疗后,随着停药时间的延长,dnmt1的表达水平逐步恢复,进一步说明表观遗传可以逆转的性质。

关键词：表观遗传学非小细胞非小细胞肺癌 dnmt1 DNA甲基化转移酶抑制剂去乙酰化酶抑制剂

miR-326、miR-330-5p和dnmt1在SLE患者外周血单个核细胞中的表达与临床意义

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miR-326、miR-330-5p和DNMT1在SLE患者外周血单个核细胞中的表达...

作者：周敬彩兰州大学

学位级别：硕士

目的:研究系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞中mi R-326、mi R-330-5p及其靶基因dnmt1的表达水平,以及其与SLE患者的临床疾病活动度关系,初步探索mi R-326和mi R-330-5p调控dnmt1的表达在系统性红... 详细信息

目的:研究系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞中mi R-326、mi R-330-5p及其靶基因dnmt1的表达水平,以及其与SLE患者的临床疾病活动度关系,初步探索mi R-326和mi R-330-5p调控dnmt1的表达在系统性红斑狼疮中的作用机制,为SLE的诊断和病情判读提供可靠的实验室指标。方法:首先,选取符合系统性红斑狼疮诊断标准的患者72例,根据系统性红斑狼疮患者系统性红斑狼疮的活动度评分(Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index,SLEDAI)标准,可以将SLE病例组分为高活动组21例(SLEDAI≥15分),中活动组25例(15分>SLEDAI≥10分)和低活动组26例(10分>SLEDAI≥5分),同时选取健康人群40例作为对照组,收集SLE病例组和健康对照组外周血单个核细胞,提取总RNA。采用实时荧光定量PCR技术(Quentitative Real-time,q PCR)技术检测mi R-326、mi R-330-5p以及dnmt1m RNA的表达水平,分析mi R-326、mi R-330-5p与dnmt1m RNA表达水平的关系,构建受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),分析mi RNA-326和mi RNA-330-5p对系统性红斑狼疮的诊断价值。结果:1.SLE患者中mi R-326的表达水平显著高于健康对照组(pdnmt1 m RNA的表达水平显著低于健康对照(Pdnmt1m RNA的表达水平呈负相关(r=-0.4836,P1);mi R-330-5p与dnmt1m RNA的表达水平呈负相关(r=-0.5922,P1)。5.mi R-326的表达诊断SLE的ROC曲线面积(AUC)为0.8919(95%可信区间=0.8087.9750);mi R-330-5P的表达诊断SLE的ROC曲线面积(AUC)为0.9028(95%可信区间=0.8385.9671)。6.dnmt1m RNA与SLEDAI的相关性分析显示两者负相关(r=0.7004,P1);mi R-326与SLEDAI的相关性分析显示两者呈正相关(r=0.5086,P1);mi R-330-5p与SLEDAI的相关性分析显示两者呈正相关(r=0.7909,P1)结论:1.mi R-326和mi R-330-5p在系统性红斑狼疮患者PBMCs中表达升高,而dnmt1m RNA在系统性红斑狼疮患者PBMCs中表达降低,提示mi R-326、mi R-330-5p和dnmt1m RNA与系统性红斑狼疮的发病有关。2.mi R-326、mi R-330-5p的表达水平与dnmt1的m RNA呈负相关,提示其可能通过抑制dnmt1m RNA的表达参与到SLE发病的分子机制。3.ROC曲线显示mi R-326和mi R-330-5p对系统性红斑狼疮有一定的诊断价值,可作为系统性红斑狼疮诊断的辅助指标。4.dnmt1的m RNA与SLEDAI呈负相关,mi R-326、mi R-330-5p与SLEDAI呈正相关,表明其可以在一定程度上反映系统性红斑狼疮患者的疾病活动度。

关键词：系统性红斑狼疮 miR-326 miR-330-5p dnmt1

RUNX3、dnmt1 mRNA在原发性肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

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RUNX3、DNMT1 mRNA在原发性肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

作者：王海全宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的研究人RUNT相关转录因子因子3（Runt-related transcription factor 3, RUNX3）和DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1, dnmt1）在原发性肝细胞癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达及其与临床病理学特征的关系,并探讨其临床意义。方法应用逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription- Polymerase chain reaction,RT-PCR）检测43例HCC患者癌组织及其相应癌旁组织中RUNX3 mRNA、dnmt1 mRNA的表达。结果肝癌组织中RUNX3表达明显降低,dnmt1表达增高;RUNX3表达下调与组织分化程度有关（P＜0.05）,而与性别、年龄、HbsAg、AFP、静脉癌栓及TNM分期均无明显关系（P＞0.05）;dnmt1表达升高与静脉癌栓、组织分化程度及TNM分期有关（P＜0.05）,与性别、年龄、HbsAg、AFP均无明显关系（P＞0.05）。RUNX3与dnmt1表达成负相关（r=-0.2059, P＜0.05）。结论RUNX3基因在肝癌组织中表达下调, dnmt1表达增高,可能与肝癌的发生发展有关;高表达的dnmt1在一定程度上参与调控RUNX3基因的表达下调。

关键词：原发性肝细胞癌 RUNX3 dnmt1 逆转录聚合酶链反应

miR-29b和dnmt1在结直肠癌中的表达及其临床病理意义的研究

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miR-29b和DNMT1在结直肠癌中的表达及其临床病理意义的研究

作者：龚鸣苏州大学

学位级别：硕士

目的:研究microRNA-29b(miR-29b)和靶基因dnmt1在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌临床病理参数的关系及意义。方法:采用原位杂交技术检测microRNA-29b,同时应用免疫组化S-P法检测临床病理资料完整的115例结直肠癌中miR-29b和dnmt1... 详细信息

目的:研究microRNA-29b(miR-29b)和靶基因dnmt1在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌临床病理参数的关系及意义。方法:采用原位杂交技术检测microRNA-29b,同时应用免疫组化S-P法检测临床病理资料完整的115例结直肠癌中miR-29b和dnmt1蛋白的表达,并采用χ2检验分析miR-29b和dnmt1与临床病理因素的关系,应用spearman等级分析两者之间的关系,应用Kaplan-Meier法及COX回归法来分析各项因素和疾病预后之间的关系,并用log-rank法来检验其差异性。结果:(1)miR-29b在结直肠癌组织中的阳性表达率(35.7%)明显低于正常肠黏膜组织(91.7%)和肠腺瘤组织(78.9%);dnmt1在结直肠癌组织中的阳性表达率(68.7%)明显高于正常肠黏膜组织(25.0%)和肠腺瘤组织(47.4%),差异均具有统计学意义(p115例结直肠癌中,有淋巴结转移结直肠癌组织中mi R-29b阳性率明显低于无淋巴结转移结直肠癌(pdnmt1阳性率明显高于无淋巴结转移结直肠癌(pdnmt1阳性率高于Dukes临床分期早期组(p1例中,dnmt1表达阳性的有20例,表达阴性的有21例,两者呈负相关性(p=0.001,r=-0.303)。(4)miR-29b阳性组中位生存期长于阴性组(27.0月vs 16.8月),5年生存率高于阴性组(51.2%vs 47.2%),p=0.025。dnmt1阳性组中位生存期短于阴性组(25.6月vs 35.3月),5年生存率低于阴性组(42.9%vs 83.3%),p1。结论:(1)miR-29b和dnmt1蛋白在结直肠癌中的表达可作为结直肠癌恶性程度的参考指标;miR-29b和dnmt1蛋白异常表达与结直肠癌发生发展有关;(2)mi R-29b低表达及dnmt1蛋白高表达与结直肠癌的淋巴结转移及肿瘤进展相关(3)miR-29b阴性及dnmt1蛋白阳性均与结直肠癌不良预后相关;(4)miR-29b及dnmt1表达呈负相关性。

关键词：结直肠腺癌 miR-29b dnmt1 原位杂交技术免疫组织化学

番泻苷A通过抑制dnmt1介导的PTEN高甲基化改善四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化

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番泻苷A通过抑制DNMT1介导的PTEN高甲基化改善四氯化碳诱导的小鼠...

作者：朱红安徽医科大学

学位级别：硕士

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是一种以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)逐渐累积于窦周间隙为特征的病理病变,其持续恶化会逐渐发展为肝硬化,最终导致肝癌,HF及其相关并发症仍然是全球范围内的重大医疗负担。肝星状细胞(hepatic ... 详细信息

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是一种以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)逐渐累积于窦周间隙为特征的病理病变,其持续恶化会逐渐发展为肝硬化,最终导致肝癌,HF及其相关并发症仍然是全球范围内的重大医疗负担。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)的表型激活变成肌成纤维细胞在HF进程中起着核心作用,HSCs是肝脏中主要的胶原生成细胞,其激活可促进HF。如果能抑制HSCs的激活和增殖,理论上可以减少甚至逆转HF的发生和发展。大量文献报道DNA甲基化可促进HSCs的激活,促进HF的进展。DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,dnmt1)能催化DNA甲基化,与多种纤维化疾病密切相关,包括肝纤维化。我们前期的实验结果表明番泻苷A(Sennoside A,SA)可以直接与dnmt1结合并抑制其活性。据文献报道,SA可以治疗肥胖、糖尿病,对肝脂肪变性也具有保护作用。然而,SA对肝纤维化的作用及其机制研究尚未有文献报道。为进一步探究SA在肝纤维化中的作用。本研究体内、体外分别采用C57BL/6J小鼠、大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,观察SA在肝纤维化中的作用及其机制。本课题的实验设计主要包含以下五个部分:1.SA在体内对肝纤维化的影响72只C57BL/6J小鼠(雄性,体重20g-22g),随机分为正常组、模型组、SA低、中、高剂量组,正常加SA高剂量组(每组12只)。模型组小鼠腹腔注射10%CCl橄榄油溶液建立肝纤维化模型,每周2次,共4周;给药组在造模第一天时开始每天给予灌胃低、中、高剂量的SA;正常组腹腔注射等剂量橄榄油。造模结束后,断食24h。处死实验小鼠,收集肝脏组织和血清。为了检测各组肝组织的损伤情况和纤维化程度,选用HE染色、血清ALT和AST生化指标检测肝组织损伤情况,选用Masson染色检测肝组织胶原沉积情况,并选用免疫组化技术检测肝纤维化标志物α-SMA的表达变化,Western blot检测collagen I(col1α1)在肝组织中的表达变化。实验结果表明,我们成功建立了用CCl诱导的小鼠纤维化模型,并且SA对其具有一定的改善作用。2.SA在体外对HSC-T6活化、增殖的影响首先采用MTT法检测不同浓度的SA对HSC-T6活性的影响,判断SA对HSC-T6毒性作用,再用TGF-β1(10ng/ml)和不同浓度的SA共同处理细胞,用MTT法筛选出SA对HSC-T6细胞的最适浓度。通过CCK8试剂盒和流式细胞术检测SA对HSC-T6细胞增殖的影响。另外,通过Western blot方法检测HSC-T6细胞中α-SMA、col1α1、Cyclin D1、C-myc和CDK5的表达水平。实验结果表明,SA能够抑制HSC-T6细胞的活化和增殖并将其阻滞在G1期。3.SA对PTEN/AKT信号通路的影响通过免疫荧光双染检测正常组,模型组和中剂量组肝脏组织中PTEN的表达变化;同时给予TGF-β1(10ng/ml)和SA(10μM)处理HSC-T6细胞48h,采用免疫荧光和Western blot检测PTEN的表达变化,同时,采用Western blot检测p-AKT和p-ERK的表达变化。HSC-T6细胞给予PTEN小干扰RNA(si RNA-PTEN)对PTEN进行沉默,然后给予TGF-β1(10ng/ml)和SA(10μM)处理48h,运用CCK8方法和流式细胞术检测SA对HSC-T6细胞增殖的影响。另外,采用Western blot方法检测HSC-T6细胞中α-SMA、col1α1、Cyclin D1、C-myc、CDK5和PTEN、p-AKT、p-ERK的表达变化。实验结果表明,SA能够使PTEN的表达上调,抑制p-AKT和p-ERK的表达,而在PTEN被沉默后再给予SA处理时,发现SA抑制HSC-T6细胞增殖的能力减弱。4.SA靶向结合dnmt1据文献报道,dnmt1介导的PTEN高甲基化导致PTEN表达缺失,引起HSCs活化。为了证实SA与dnmt1的相互作用,我们采用SPR法检测SA与dnmt1的结合亲和力。使用dnmt1活性试剂盒测定SA对其活性的影响。实验结果表明,SA可以与dnmt1结合,并减小肝纤维化中dnmt1的活性。5.过表达dnmt1后SA对HSC-T6的活化和增殖的影响在HSC-T6细胞上采用dnmt1过表达质粒对dnmt1进行过表达,再给予TGF-β1(10ng/ml)和SA(10μM)处理48h,通过Western blot来检测过表达效率,CCK8法用来检测过表达dnmt1对HSC-T6细胞活性的影响;流式细胞术用来检测过表达dnmt1对HSC-T6细胞周期的影响;Western blot实验用来探究过表达dnmt1对SA抑制α-SMA、col1α1、Cyclin D1、C-

关键词：番泻苷A 肝纤维化肝星状细胞 dnmt1 增殖