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CAS9 is a genome mutator by directly disrupting dna-pk dependent dna repair pathway

Protein & Cell 2020年第5期11卷 352-365页

作者： Shuxiang Xu Jinchul Kim Qingshuang Tang Qu Chen Jingfeng Liu Yang Xu Xuemei Fu Cancer Research Institute Guangdong Provincial Key Laboratory of Cancer ImmunotherapySchool of Basic Medical SciencesSouthern Medical UniversityGuangzhou 510515China The Eighth Affiliated Hospital Sun Yat-sen UniversityShenzhen 518033China Division of Biological Sciences University of CaliforniaSan Diego9500 Gilman DriveLa JollaCA 92093USA Shenzhen Children’s Hospital Shenzhen 518026China

With its high efficiency for site-specific genome editing and easy manipulation,the clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated protein 9(CAS9)system has become the most widely used gene editing technology in biomedical *** addition,significant progress has been made for the clinical development of CRISPR/CAS9 based gene therapies of human diseases,several of which are entering clinical *** we report that CAS9 protein can function as a genome mutator independent of any exogenous guide RNA(gRNA)in human cells,promoting genomic dna double-stranded break(DSB)damage and genomic ***9 interacts with the KU86 subunit of the dna-dependent protein kinase(dna-pk)complex and disrupts the interaction between KU86 and its kinase subunit,leading to defective dna-pk-dependent repair of dna DSB damage via non-homologous end-joining(NHEJ)***9 is a CAS9 variant with potentially higher fidelity and broader compatibility,and dCAS9 is a CAS9 variant without nuclease *** show that XCAS9 and dCAS9 also interact with KU86 and disrupt dna DSB *** the critical roles of dna-pk in maintaining genomic stability and the pleiotropic impact of dna DSB damage responses on cellular proliferation and survival,our findings caution the interpretation of data involving CRISPR/CAS9-based gene editing and raise serious safety concerns of CRISPR/CAS9 system in clinical application.

关键词： KEYWORDS CAS9 dna-pk dna double-stranded breaks genetic instability dna repair

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Cell polarity protein Par3 complexes with dna-pk via Ku70 and regulates dna double-strand break repair

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Cell Research 2007年第6期17卷 100-116页

作者： TimTakKwok SiuKaiKong BenjaminChen DavidJChen Graduate School of the Chinese Academy of Sciences Shanghai 200031China Department of Biochemistry The Chinese University of Hong KongHong Kong SARChina

The partitioning-defective 3 (Par3),a key component in the conserved Par3/Par6/apkC complex,plays fundamentalroles in cell *** we report the identification of Ku70 and Ku80 as novel Par3-interacting proteins throughan in vitro binding assay followed by liquid chromatography-tandem mass ***70/Ku80 proteins are twokey regulatory subunits of the dna-dependent protein kinase (dna-pk),which plays an essential role in repairingdouble-strand dna breaks (DSBs).We determined that the nuclear association of Par3 with Ku70/KuS0 was enhancedby y-irradiation (IR),a potent DSB ***,dna-pkcs,the catalytic subunit of dna-pk,interacted withthe Par3/Ku70/Ku80 complex in response to ***3 over-expression or knockdown was capable of up-or downregulat-ing dna-pk activity,***,the Par3 knockdown cells were found to be defective in random plasmidintegration,defective in DSB repair following IR,and radiosensitive,phenotypes similar to that of Ku70 *** findings identify Par3 as a novel component of the dna-pk complex and implicate an unexpected link ofcell polarity to DSB repair.

关键词： cell polarity DSB repair dna-pk Ku70/Ku80/Par3

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dna-pk抑制剂联合溶瘤病毒增强对肝癌的抗肿瘤活性研究

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中国免疫学杂志 2021年第18期37卷 2231-2234,2239页

作者：吴育民杜端明刘春霖洪跃飞江磊昌罗伟芝彭尧 JOHN Bell 深圳市第二人民医院介入治疗科深圳518000 广州医科大学基础医学院广州510182 渥太华健康研究所渥太华999040

目的:寻找协同增强VSVΔ51溶瘤病毒(OV)对肝癌杀伤作用的小分子化合物并探索其协同机制。方法:通过将不同机制的抗肿瘤活性的小分子化合物与VSVΔ51联合,筛选对肝癌细胞裂解能力最强的药物组合;通过体内抑瘤能力实验检测联合疗法的体内... 详细信息

目的:寻找协同增强VSVΔ51溶瘤病毒(OV)对肝癌杀伤作用的小分子化合物并探索其协同机制。方法:通过将不同机制的抗肿瘤活性的小分子化合物与VSVΔ51联合,筛选对肝癌细胞裂解能力最强的药物组合;通过体内抑瘤能力实验检测联合疗法的体内抗肿瘤活性;通过电镜观测联合疗法处理后内质网的肿胀程度及Western blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白的水平,探索联合疗法协同增效的机制。结果:细胞存活实验表明,dna-pk抑制剂M3814与VSVΔ51联合后较M3814单独给药细胞毒性明显增强,沉默靶细胞dna-pkcs基因后也能显著增强VSVΔ51的肿瘤裂解能力(P<0.0001);体内实验表明,M3814与VSVΔ51联合治疗较单独治疗而言肿瘤抑制能力显著增强(P<0.001);电镜观测结果显示M3814与VSVΔ51联合处理靶细胞后内质网肿胀程度增加(P<0.001),Western blot检测结果表明,M3814与VSVΔ51联合治疗后的肿瘤组织中凋亡相关蛋白表达增加(P<0.001)。结论:M3814联合VSVΔ51可以增强内质网应激诱导肝癌细胞凋亡,有可能为肝癌的治疗提供新的方案。

关键词：肝细胞癌溶瘤病毒 dna-pk 肿瘤免疫治疗

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EXPRESSION AND SUBCELLULAR LOCALIZATION OF dna-pk IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINES CNE1 AND CNE2 WITH DIFFERENT RADIOSENSITIVITY

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Chinese Journal of Cancer Research 2006年第2期18卷 77-82页

作者：仲萍萍贺玉香夏云飞严珊珊 State Key Laboratory of Oncology in Southern China Department of Radiation Oncology Cancer Center Sun Yat-sen University Guangzhou 510060

Objective： Radiosensitivity is mainly determined by the number of dna double-strand breaks （DSBs） induced by ionizing radiation and the extent of its repair. The dna-pk complex formation is one of the major pathways by which the mammalian cells respond to DSBs repairing. Our previous study suggested that CNE1 is more radioresistant than CNE2. This study was designed to answer whether the radiosensitive difference of Nasopharyngeal Carcinoma cell lines CNE1/CNE2 was related to the expression and localization of Ku70/Ku80/dna-pkcs. Methods： Immunohistochemistry was performed to detect the subcellular localization of Ku70/Ku80/dna-pkcs in NPC cells lines CNE1 and CNE2. Western-blot was used to determine the expression of Ku protein in total extract of CNE1 and CNE2 and semi-quantitative assay of protein expression was performed to estimate the optic density （OD） value of each band using automatic image analysis system. Results： Ku70/Ku80/dna-pkcs primarily located in the nuclei. A part of nucleolus in CNE1 and CNE2 showed positive dyeing of dna-pkcs. Protein expression of Ku70/Ku80/dna-pkcs was detected in CNE1 and CNE2, and the integral optical density （IOD） of Ku70 protein was 22.03 ± 7.56 and 19.98 ± 6.04 respectively （t=0.021, P〉0.05）, while the IODs of Ku80 protein in the two cell lines were 33.44 ± 12.87 and 28.98 ± 9.24 respectively （t=0.24, P〉0.05）, and the IODs of dna-pkcs protein were 45.03 ± 1.77 and 40.87 ± 4.19 （t=1.58, P〉0.05）. The above results suggested that the basic expression of Ku70/Ku80/dna-pkcs had no statistic difference between the different radiosensitive NPC cell lines CNE1 and CNE2. Conclusion： The variation of radiosensitivity in NPC cell lines CNE1 and CNE2 has no obviously correlation with the subcellular localization and basic expression of dna-pk protein. So we presumed that the difference of radiosensitivity between CNE1 and CNE2 may be on account of some other factors than subcellular localization and basic expression of dna-pk.

关键词： Nasopharyngeal carcinoma Radiosensitivity dna-pk

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Ser/Thr protein phosphatase PP6 regulates the radiosensitivity of glioblastoma cells through dna-pk

Ser/Thr protein phosphatase PP6 regulates the radiosensitivi...

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中国生物化学与分子生物学会第十届会员代表大会暨全国学术会议

作者： Na Jiang Ying Shen Yongbin Wang Xianming Kong Jun Mi Ren Ji hospital Shanghai Jiao Tong University school of medicine Institute of Medical Science Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

dna-pk(dna-dependent protein kinase) is a critical protein kinase in response to dna damage,especially to dna double-strand breaks(DSB).dna-pk is abundantly expressed in mammalian cells of various organ and *** dna repair,dna-pk is also involved in the metabolic gene regulation in response to *** current data have demonstrated dna damage induces the phosphorylation of dna-pkcs(dna-pk catalytic subunit), however,the regulatory mechanism of dna-pk activation is still *** study show the Serine/Threonine protein phosphatase PP6 is complexed with dna-pk,the expression of PP6c(PP6 catalytic subunit) is associated with the radio-resistance of glioblastoma(GBM) cells and highly related with the survival time of GBM patients;the siRNA

关键词： dna-pk PP6 ubiquitination VCP

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dna-pk作为放化疗增敏靶点的研究进展

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中华肿瘤防治杂志 2009年第1期16卷 74-77,80页

作者：庄亮于世英华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心湖北武汉430030

目的:总结国内外对dna依赖性蛋白激酶(dna-dependent protein ki-nase,dna-pk)作为放化疗增敏靶点研究的现状。方法:检索Medline及CHKD期刊全文数据库检索系统,以"dna-pk、放射敏感性和化疗敏感性"为关键词,检索1998-01-2008-03关于dna... 详细信息

目的:总结国内外对dna依赖性蛋白激酶(dna-dependent protein ki-nase,dna-pk)作为放化疗增敏靶点研究的现状。方法:检索Medline及CHKD期刊全文数据库检索系统,以"dna-pk、放射敏感性和化疗敏感性"为关键词,检索1998-01-2008-03关于dna-pk研究的文献,共检索到英文文献1660篇,中文文献115篇。纳入标准:1)dna-pk的功能;2)dna-pk作为肿瘤治疗靶点的研究;3)dna-pk抑制剂研究。根据纳入标准,精选82篇文献,最后纳入分析35篇文献。结果:放射线和类放射线药物均可导致肿瘤细胞dna双链断裂(DSB),从而杀伤肿瘤细胞,dna-pk具有包括促进DSB修复在内的诸多功能。抑制dna-pk的功能和活性,就可抑制DSB的修复,提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。结论:dna-pk可以成为肿瘤治疗的理想靶点,但在临床应用方面仍有很多问题需要解决。

关键词： dna-pk 辐射耐受性化疗敏感性综述文献

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dna-pk在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

DNA-PK在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

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作者：胡荣杭重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:检测dna-pk三个亚基:dna-pkcs、Ku70、Ku80在食管鳞状细胞癌中的表达情况,探讨dna-pk表达与食管鳞状细胞癌及其临床病理特征之间的关系。方法:用免疫组化法检测52例食管鳞癌组织、癌旁组织以及正常组织中dna-pkcs、Ku70、Ku80的表... 详细信息

目的:检测dna-pk三个亚基:dna-pkcs、Ku70、Ku80在食管鳞状细胞癌中的表达情况,探讨dna-pk表达与食管鳞状细胞癌及其临床病理特征之间的关系。方法:用免疫组化法检测52例食管鳞癌组织、癌旁组织以及正常组织中dna-pkcs、Ku70、Ku80的表达情况,并对其在不同临床病理特征中的表达进行比较。用x2检验及费歇尔精确概率检验对结果进行统计学分析。结果:dna-pkcs在食管癌组织、癌旁组织和正常组织中均有表达,其在食管癌组织中的表达高于癌旁组织(P0.05)。Ku70和Ku80在食管癌组织、癌旁和正常组织中亦均有表达,但经统计学处理,表达没有显著差异(P>0.05)。在食管癌组织中dna-pkcs、Ku70、Ku80的表达阳性率为84.6%、67.3%、65.3%;dna-pkcs的表达强度高于Ku70(P0.05)。dna-pkcs在高分化食管癌中的表达高于中分化(P0.05)。结论:dna-pkcs、Ku70、Ku80在食管癌、癌旁及正常组织中均有表达,表明dna-pk对dna的损伤修复能力作为一种基本的细胞功能在良恶性组织中普遍发挥作用。dna-pkcs、Ku70/80在食管癌组织中的表达不平衡可能影响DSBs修复,导致食管癌形成。dna-pkcs在食管癌组织中高表达,提示dna-pkcs可能是食管癌组织区别于食管正常组织的一个生物标记物;dna-pkcs在高分化食管癌中高表达,提示dna-pk可能与食管癌的分化程度相关。

关键词：食管鳞癌 dna-pk 免疫组化

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电针预处理对AMI小鼠心肌局部炎症及dna-pk/Rictor/Myc信号通路的影响

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南京中医药大学学报 2024年第6期40卷 589-597页

作者：江敏娇彭柔闫煜杭刘肖儿钱丹颖鲁晓涵陈栎遥于美玲卢圣锋南京中医药大学针药结合教育部重点实验室江苏南京210023 南京中医药大学附属张家港医院江苏苏州215600 南京中医药大学养老服务与管理学院江苏南京210023

目的观察内关穴电针预处理后急性心肌梗死小鼠(AMI)心功能、局部炎症水平及巨噬细胞M2型极化变化,并从调控dna-pk/Rictor/Myc信号通路角度探讨其可能机制。方法将雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组和电针组,每组10只。采用结扎... 详细信息

目的观察内关穴电针预处理后急性心肌梗死小鼠(AMI)心功能、局部炎症水平及巨噬细胞M2型极化变化,并从调控dna-pk/Rictor/Myc信号通路角度探讨其可能机制。方法将雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组和电针组,每组10只。采用结扎冠状动脉左前降支制备心肌缺血模型。电针组接受双侧内关穴电针干预,疏密波,2/15 Hz,1 mA,每次20 min,每日1次,连续3 d,电针干预结束后30 min造模。采用超声心动图检测心脏射血分数(EF)和短轴收缩率(FS);HE、TUNEL染色观察小鼠心肌病理形态和心肌细胞凋亡;免疫组化和ELISA法检测梗死区心肌组织和外周血中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表达水平;流式细胞术检测心脏中巨噬细胞极化状态,Western blot法检测梗死心肌中dna-pk、p-dna-pk、Rictor、Myc的蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组的EF、FS明显降低(Pdna-pk、Rictor和Myc蛋白表达水平明显降低(Pdna-pk、Rictor和Myc蛋白表达显著升高(Pdna-pk/Rictor/Myc信号通路,促进巨噬细胞M2极化,减轻局部炎症,减少心肌细胞凋亡,从而提高心功能,实现心肌保护效应。

关键词：心肌梗死电针预处理巨噬细胞极化 dna-pk Rictor

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益气除痰方对肺癌A549移植瘤细胞凋亡途径Caspase-4及dna-pk的影响

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中药材 2015年第6期38卷 1247-1250页

作者：李舒王淑美杨洋博君刘启欧重庆医科大学重庆400016

目的:探讨益气除痰方是否通过内质网UPR介导的细胞凋亡途径发挥抗肿瘤作用。方法:建立40只肺癌A549裸鼠皮下移植瘤模型,于接种第7天将小鼠随机分为模型组(生理盐水组)、顺铂注射液组(0.002 g/kg)、益气除痰方(3.0 g/kg)+顺铂注射液(0.00... 详细信息

目的:探讨益气除痰方是否通过内质网UPR介导的细胞凋亡途径发挥抗肿瘤作用。方法:建立40只肺癌A549裸鼠皮下移植瘤模型,于接种第7天将小鼠随机分为模型组(生理盐水组)、顺铂注射液组(0.002 g/kg)、益气除痰方(3.0 g/kg)+顺铂注射液(0.002 g/kg)组及益气除痰方低、高剂量组(3.0、6.0 g/kg),每组8只。中药灌胃给药,1次/d,连用21 d。顺铂注射液腹腔注射,1次/d,连用7 d。干预第22天,处死所有小鼠,测量瘤体质量、体积,采用免疫组化及Western blot法检测肿瘤组织中Caspase-4、dna-pk的表达。结果:与模型组比较,益气除痰方各剂量组及益气除痰方+顺铂注射液组肿瘤体积、肿瘤质量显著降低,肿瘤组织中Caspase-4、dna-pk表达均显著升高(Pdna-pk蛋白的表达介导细胞凋亡途径有关。

关键词：益气除痰方肺癌细胞凋亡 Caspase-4 dna-pk

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dna-pk蛋白的表达与鼻咽癌放射敏感性关系的实验研究

DNA-PK蛋白的表达与鼻咽癌放射敏感性关系的实验研究

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作者：曲颂广西医科大学

学位级别：硕士

【研究背景与目的】鼻咽癌( nasopharyngeal carcinoma,NPC )是我国常见的恶性肿瘤之一,在我国南方地区尤为高发,由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌细胞对射线较为敏感的特点,放射治疗被认为是首选的治疗手段。近年来,由于放疗设备不... 详细信息

【研究背景与目的】鼻咽癌( nasopharyngeal carcinoma,NPC )是我国常见的恶性肿瘤之一,在我国南方地区尤为高发,由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌细胞对射线较为敏感的特点,放射治疗被认为是首选的治疗手段。近年来,由于放疗设备不断更新、放疗技术更趋完善、放射物理及放射生物学研究的不断进步,使NPC单纯放疗的疗效得到较大的提高,目前,单纯放疗5年生存率已超过50%。众所周知,病理类型、临床分期、患者年龄、体质等是影响NPC预后的主要因素,但在日常的临床工作中也不难发现,前述情况基本相似的不同患者,其治疗效果却有较大差异,治疗失败的原因之一为放射抗拒,故研究其抗拒机制、寻找放射增敏途径是提高治愈率的途径之一,在放射治疗前即对其放射敏感性作出预测性分析是目前放射生物学的研究热点之一。放射线导致细胞损伤的主要靶点是dna,由放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致的dna单链和双链断裂损伤,其中以dna双链断(dna double-strand break,DSB)裂损伤最为重要。放射敏感性主要与照射后dna双链断裂的数目及其修复的程度有关,人类的DSB修复以非同源末端连接途径(non-homology end joining , NHEJ)为主,参与NHEJ的主要成份有dna-pkcs、Ku70、Ku80、ligaseⅣ、XRCC4。dna-pk(dna dependent protein kinase)是哺乳动物细胞中参与NHEJ主要的分子途径之一,是由Ku70、Ku80、dna-pkcs三个亚基组成。其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基,在DSB修复中起着辨认、结合排列dna末端并募招催化亚基dna-pkcs的作用。它由分子量为70kDa的Ku70和80～87kDa的Ku80 (又称Ku86 )组成,dna-pk催化亚基dna-pkcs分子量为470kDa

关键词：鼻咽癌 dna-pk 放射敏感性细胞株预后

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