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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF5基因的克隆、核酸疫苗构建及鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF5基因的克隆、核酸疫苗构建及鉴...

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作者：韩贞珍延边大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要引起母猪的繁殖障碍，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。目前对PRRS的防治尚无切实有效的方法，主要采取疫苗免疫接种和综合防治相结合的方法。用于该病防制的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗。但灭活苗主要引... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要引起母猪的繁殖障碍，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。目前对PRRS的防治尚无切实有效的方法，主要采取疫苗免疫接种和综合防治相结合的方法。用于该病防制的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗。但灭活苗主要引起体液免疫，而猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有抗体依赖性增强作用(ADE)，因此在PRRS防治上受到一定的限制。而弱毒苗主要是在安全方面存在一定的问题，例如在接种弱毒疫苗后造成经胎盘感染胎儿等，对繁殖性能造成不利影响，精液带毒和精液质量下降现象，还可能造成疫苗毒的传播，引起PRRSV的持续感染和病毒血症，有些猪群出现急性PRRS样综合症状。所以对弱毒疫苗在推广使用前必须进行大量全面的试验研究。因此对PRRS等免疫抑制性疾病的防制，常规疫苗不能起到较好的效果。由于核酸疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫，可以对不同血清型的毒株产生交叉保护性，因此核酸疫苗有望成为重要研究方向。本研究首先根据已发表的PRRSV国内分离株HB-1株的核苷酸序列，设计了引物，用RT-PCR的方法扩增了PRRSV长春分离株ORF6、ORF5两个重要的免疫原性基因，经凝胶电泳回收后克隆到pMD-18T载体上，经酶切鉴定后进行序列测定。序列分析表明PRRSV长春分离株与标准美洲株的核苷酸与氨基酸同源性较高，ORF6基因核苷酸序列的同源性达95.4％，ORF5基因核苷酸序列的同源性达89.6％;ORF6基因氨基酸序列的同源性达97.1％，ORF5基因氨基酸序列的同源性达89.1％。表明PRRSV长春分离株属于美洲型。将ORF6基因克隆至真核表达载体pVAX1上，构建重组质粒pVAX1-ORF6。辅以超抗原SEA构建了含内源性佐剂的重组质粒pVAX1-SEA-ORF6，同时将ORF6、ORF5基因串联构建了重组质粒pVAX1-SEA-ORF6-ORF5，将构建的三种重组质粒转染BHK-21细胞，通过IFA，RT-PCR检测方法表明，所构建的3个重组质粒能在真核细胞中进行有效的转录，并表达了目的蛋白(M)、(GP5)。综上所述，本试验成功构建了表达ORF6、ORF5基因的PRRS核酸疫苗。为新型PRRS疫苗的研究奠定了基础，并提供科学依据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒克隆 dna重组体疫苗

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高致病性禽流感HA基因dna表达盒的构建及免疫效力研究

高致病性禽流感HA基因DNA表达盒的构建及免疫效力研究

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作者：田宇飞吉林大学

学位级别：硕士

高致病性禽流感(HPAI)死亡率极高,对养禽业造成毁灭性打击,并严重威胁人类健康和生命安全。本研究构建了针对H5、H7亚型禽流感病毒HA基因的dna重组体,并进行了小鼠免疫试验研究。通过RT-PCR的方法获得了禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jilin/... 详细信息

高致病性禽流感(HPAI)死亡率极高,对养禽业造成毁灭性打击,并严重威胁人类健康和生命安全。本研究构建了针对H5、H7亚型禽流感病毒HA基因的dna重组体,并进行了小鼠免疫试验研究。通过RT-PCR的方法获得了禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jilin/9/(H5N1)(JL9/04)血凝素(HA)基因,通过人工合成方法获得H7亚型HA基因,分别克隆到pUCm-T与pMD18-T载体。将H5HA、H7HA基因以融合表达方式克隆到真核表达载体pVAX1中,获得了重组表达质粒pVAX1-H57,并用限制性酶切、PCR、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot等方法对pVAX1-H57进行了鉴定与体外表达研究。将构建的H5H7基因dna重组体免疫小鼠,并对其诱导的体液和细胞免疫指标进行检测。结果表明,其能诱导小鼠产生特异性的体液及细胞免疫应答。

关键词：高致病性禽流感 HA基因 dna重组体免疫效力

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