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应用荧光定量PCR法对白色念珠菌胞外dna释放的动力学研究

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应用荧光定量PCR法对白色念珠菌胞外DNA释放的动力学研究

作者：高峰中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

侵袭性真菌病是导致免疫缺陷病人和危重病人死亡的主要原因之一。随着肿瘤、血液病及获得性免疫缺陷病人的逐年增多，侵袭性真菌病特别是白色念珠菌病日益受到医学界的重视。其中，白色念珠菌感染可占临床念珠菌感染的45％左右。本病危... 详细信息

侵袭性真菌病是导致免疫缺陷病人和危重病人死亡的主要原因之一。随着肿瘤、血液病及获得性免疫缺陷病人的逐年增多，侵袭性真菌病特别是白色念珠菌病日益受到医学界的重视。其中，白色念珠菌感染可占临床念珠菌感染的45％左右。本病危害性大、死亡率高，尚缺乏有效的诊断手段。常规血液培养阳性率低、耗时长;检测真菌循环抗原(体)、特异性酶和代谢产物的血清学方法则存在特异性和敏感性低的缺陷。检测方法的局限性导致真菌病的早期明确诊断十分困难，是影响患者预后的重要因素之一。因而建立一种特异、灵敏、高效、快速的检测系统是检验工作者急需解决的一个问题。 PCR法可以检测出微量的真菌dna，已成为真菌检测的一个研究热点。而Real Time PCR，即实时检测PCR扩增产物并进行解析的方法，不仅秉承和发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等全部优点，同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等的不足。由于其操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等特点，近年来开始受到真菌检测研究者的关注。无论是普通PCR法还是Real Time PCR法检测菌株的目的都是要为临床服务，所以临床标本的选择很重要。选用血液标本早已达成共识，但具体而言，全血标本和血清标本哪一种更利于真菌的PCR早期

关键词：白色念珠菌荧光定量PCR 游离dna dna释放

大肠杆菌TA系统基因hipBA对生物膜的形成以及dna释放的影响

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大肠杆菌TA系统基因hipBA对生物膜的形成以及DNA释放的影响

作者：赵俊桥山东大学

学位级别：硕士

自然界当中的细菌大多是群体聚集在表面形成称为生物膜的结构的方式存在的,相比较而言,以游离的、单独存在的方式生活的细菌并不是很常见。在生物膜当中,细菌大多通过其表面的附属物比如鞭毛和菌毛相互作用,直至聚集在一起形成菌落,之... 详细信息

自然界当中的细菌大多是群体聚集在表面形成称为生物膜的结构的方式存在的,相比较而言,以游离的、单独存在的方式生活的细菌并不是很常见。在生物膜当中,细菌大多通过其表面的附属物比如鞭毛和菌毛相互作用,直至聚集在一起形成菌落,之后由细菌产生的一些基质如多糖、糖蛋白以及dna继续形成和完善生物膜的结构。这些多细胞的行为方式对一些寄生菌非常重要,因为80%的人类慢性炎症和传染病中都可以发现生物膜的存在。形成生物膜在某些方面对于工业上的发酵生产是很不利的。所以将生物膜生长缺陷型的大肠杆菌应用到生物技术领域的方法已经得到发展。大肠杆菌毒素-抗毒系统（TA系统）是被证实与生物膜形成相关的一类基因。在TA系统中,一个基因编码稳定的毒素蛋白,可干扰细胞正常的生理进程,进而使细胞裂解死亡。同时另一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白,抗毒素蛋白可以结合到毒素蛋白上,进而抑制毒素蛋白的活性。最近的许多研究表明,细胞的死亡和裂解在生物膜的形成过程中发挥着重要作用。大肠杆菌TA系统在生物膜形成中的作用是有限的和有争议的。Kim等人研究认为,TA系统可以通过调节YjgK基因的表达来影响菌毛的形成,而菌毛对生物膜的中细菌的粘附以及分离起着重要的作用。而Kolodkin-Gal等人在MC4100中研究发现,TA系统中的基因都是通过不同的影响细胞死亡的方式来影响生物膜的形成的。同时TA系统是大肠杆菌中的关键的抗性因子。目前TA系统和细胞的死亡和裂解对生物膜形成的联系仍然是未知的。在本研究中,主要利用hip功基因来进行研究TA系统与生物膜形成之间的关系。首先构建hip缺失的BW25113菌株,来探究hip以及TA系统在生物膜形成上的作用。实验结果表明,敲除了hip基因对BW25113的生物膜形成情况有着很大的影响,hip突变株的生物膜形成与野生型相比较下降比较明显。本研究首次报道了在没有抗生素添加的情况下,hip对大肠杆菌的生物膜形成有影响。在静态情况下以及在Flow Chamber中,敲除TA系统基因的大肠杆菌在没有抗生素添加的情况下可以明显的减少生物膜的量以及结构。 dna被广泛的认为是细菌生物膜中的一种重要的结构物质,本研究从大肠杆菌BW25113的生物膜中分离得到了dna,并且BW25113和其hipA突变株的胞外dna的含量是不同的。再者,利用dnase Ⅰ处理大肠杆菌野生型的生物膜会造成生物膜的明显减少,但是对TA系统突变菌株的变化不是很明显。结合胞外dna在大肠杆菌生物膜中存在的事实,说明TA系统在生物膜的形成过程中起着重要的作用以及胞外dna是大肠杆菌生物膜的一种非常重要的结构物质。所以我们得出结论,TA系统能影响大肠杆菌的生物膜的形成并且这种影响是通过影响胞外dna的释放来实现的。而β-半乳糖苷酶测细胞裂解实验结果表明,BW25113和其hipA突变株JW1500的细胞裂解量是不同的,野生型BW25113有着更大的裂解量,所以我们推测hipA基因是通过细胞裂解来影响dna的释放的。总之,本研究首次报道了hipA在无抗生素添加的情况下可影响大肠杆菌生物膜的形成,并且提出了TA系统影响生物膜形成的一种新的机制,即TA系统可通过影响调节胞外dna含量来影响生物膜的形成。

关键词：生物膜 TA系统胞外dna 细胞裂解 dna释放大肠杆菌

亚胺培南对铜绿假单胞菌敏感和耐药菌株dna释放的影响

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现代生物医学进展 2013年第34期13卷 6605-6608,6646页

作者：舒文婷刘小玲薛亮刘潇刘敬周新王达利彭代智遵义医学院附属医院烧伤整形科贵州遵义563000 第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室实验室重庆400038 广东中山大学附属第一医院烧伤科广东广州510080

目的:观察亚胺培南对铜绿假单胞菌标准菌株和耐药菌株体外培养释放dna的影响。方法:选择铜绿假单胞菌的标准菌株和临床分离耐药菌株作为实验菌株,检测其亚胺培南的最低抑菌浓度(MIC),琼脂糖凝胶电泳法观察不同浓度亚胺培南作用下铜绿假... 详细信息

目的:观察亚胺培南对铜绿假单胞菌标准菌株和耐药菌株体外培养释放dna的影响。方法:选择铜绿假单胞菌的标准菌株和临床分离耐药菌株作为实验菌株,检测其亚胺培南的最低抑菌浓度(MIC),琼脂糖凝胶电泳法观察不同浓度亚胺培南作用下铜绿假单胞菌的dna释放情况,并用Quantity One软件分析所释放dna片段的分子量和含量。结果:亚胺培南作用下铜绿假单胞菌从1/2MIC开始释放小片段dna,大于1/2MIC仅释放1条大片段dna,且含量少,等于1/2MIC可释放3条dna,但无小片段dna,小于1/2MIC可释放4-5条dna,且含量多。1/16MIC时,标准菌株释放的第1、5条dna片段含量偏少,3、4条dna片段含量偏多,而耐药菌株相反。耐药菌株与标准菌株相比释放的dna片段有所不同,耐药菌株比标准菌株多释放一条dna片段(第2条),分子量为2784bp,耐药菌株的第1、3、4、5条dna片段分子量均比标准菌株小。耐药菌株释放的第3、4、5条dna含量明显高于标准菌株,P释放不同片段大小和含量的dna分子,耐药菌株与标准菌株释放的dna片段数量和含量有明显差异,其与耐药机制的关系值得进一步研究。

关键词：亚胺培南 dna释放铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌重组菌株的dna释放及其表达产物分泌的研究

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枯草芽孢杆菌重组菌株的DNA释放及其表达产物分泌的研究

哌拉西林/他唑巴坦体外诱导铜绿假单胞菌释放dna的初步研究

湖北省遗传学会、江西省遗传学会2006年学术年会暨学术讨论会

作者：李美菊王小娟张扬陈向东沈萍武汉大学生命科学学院武汉大学生命科学学院武汉大学生命科学学院武汉大学生命科学学院武汉大学生命科学学院

首次采用灵敏、快速、准确的荧光定量PCR技术对枯草芽孢杆菌重组菌株 DB104／pAPR8-1(含有地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE的重组质粒)培养过程中释放碱性蛋白酶基因的规律进行了研究。结果表明,在对数生长的初期,存在一个该dna片段的... 详细信息

首次采用灵敏、快速、准确的荧光定量PCR技术对枯草芽孢杆菌重组菌株 DB104／pAPR8-1(含有地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因aprE的重组质粒)培养过程中释放碱性蛋白酶基因的规律进行了研究。结果表明,在对数生长的初期,存在一个该dna片段的分泌峰, 浓度高达每微升1．5×1012个拷贝,且在稳定期以后,培养液中存在大量的该dna片段。进一步采用转化方法对分泌的dna的转化活性进行检测,结果表明,在培养液中确实存在具有生物学活性的质粒dna分子,且在对数生长的初期,细菌分泌具有转化活性的质粒这一现象与该时期细菌的感受态形成在时间上具有精确的一致性。进一步对克隆的碱性蛋白酶基因表达产物(碱性蛋白酶)的分泌情况进行了检测,结果发现在对数生长期dna分泌的同时,亦能检测到分泌到胞外的碱性蛋白酶活性,推测在这一时期dna的分泌和蛋白酶的分泌存在一定的相关性。具体机制尚在进一步的研究中。

关键词：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶 dna释放荧光定量PCR技术

来源： cnki会议评论

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中华烧伤杂志 2005年第2期21卷 93-96页

作者：彭代智 Charles H.Guymon Albert T.McManus 肖光夏第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038 U.S.Army Institute of Surgical Research

目的　观察不同浓度哌拉西林/他唑巴坦在体外诱导铜绿假单胞菌释放dna的情况。方法　选择体外对铜绿假单胞菌菌株敏感的哌拉西林/他唑巴坦为本研究所用抗生素。制备铜绿假单胞菌菌液后,测定其浓度并检测哌拉西林/他唑巴坦最低抑菌浓度(M... 详细信息

目的　观察不同浓度哌拉西林/他唑巴坦在体外诱导铜绿假单胞菌释放dna的情况。方法　选择体外对铜绿假单胞菌菌株敏感的哌拉西林/他唑巴坦为本研究所用抗生素。制备铜绿假单胞菌菌液后,测定其浓度并检测哌拉西林/他唑巴坦最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC).将不同稀释度的哌拉西林/他唑巴坦加入铜绿假单胞菌菌液中,于37℃下培养4、24h,取其上清液,采用加入SYBRGold染料的dna电泳法检测其dna释放情况。　结果　无论有无哌拉西林/他唑巴坦的作用,体外培养4h的铜绿假单胞菌均未测得dna释放。无哌拉西林/他唑巴坦时,铜绿假单胞菌在体外培养24h可自发释放一定量的dna分子,其碱基对数目分布在>2 000bp和释放的dna分子碱基对数目仍分布在上述两个区域, 但dna分子明显增多。哌拉西林/他唑巴坦在大于MIC时,仅诱导铜绿假单胞菌释放少量dna.结论　自然生长情况下铜绿假单胞菌可释放一定量的dna分子。不同浓度的哌拉西林/他唑巴坦诱导铜绿假单胞菌释放的dna分子,在碱基对数目和分子数量方面均有明显差别。

关键词：哌拉西林/他唑巴坦铜绿假单胞菌体外诱导最低抑菌浓度(MIC) 步研究 dna分子 dna释放最低杀菌浓度不同浓度体外培养 SYBR Gold 分子数量 24h 抗生素研究所稀释度上清液对数碱基菌液检测测定定量分布

枯草芽胞杆菌BG2036胞外释放dna现象与其缺陷性原噬菌体PBSX的相关性研究

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枯草芽胞杆菌BG2036胞外释放DNA现象与其缺陷性原噬菌体PBSX的相...

枯草芽胞杆菌BG2036胞外释放dna现象与其缺陷性原噬菌体PBSX的相关性研究

湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会

作者：晋婷婷唐玮陈向东武汉大学生命科学学院微生物遗传学实验室

PBSX是一种广泛存在于枯草芽胞杆菌中的缺陷性原噬菌体,在包装过程中不能正确包裹自身的染色体dna,而是随机包裹一段13 kb大小的宿主染色体dna。丝裂霉素C可诱导PBSX的大量产生。成熟的PBSX颗粒不能将自身包裹的dna注入细胞,但可通过大... 详细信息

PBSX是一种广泛存在于枯草芽胞杆菌中的缺陷性原噬菌体,在包装过程中不能正确包裹自身的染色体dna,而是随机包裹一段13 kb大小的宿主染色体dna。丝裂霉素C可诱导PBSX的大量产生。成熟的PBSX颗粒不能将自身包裹的dna注入细胞,但可通过大量吸附裂解其敏感菌株枯草芽胞杆菌W23。双层平板实验证明PBSX不能产生正常噬菌斑。枯草芽胞杆菌BG2036的培养液上清经浓缩,dna纯化后,电泳检测,可观察到约13 kb大小的dna条带。且BG2036的培养液上清与W23菌液混合后,通过测定OD的变化可间接检测BG2036培养液上清中PBSX的相对浓度,Elisa法可提高该检测的灵敏度。对PBSX的脚手架蛋白基因xkdG进行缺失后,无论是经丝裂霉素C诱导的还是非诱导的BG2036培养液,其上消中均检测不到13kb大小的dna条带,测定BG2036野生株和突变株的生长曲线,证明xkdG的缺失不会影响BG2036的正常生长。

关键词：枯草芽胞杆菌 dna释放缺陷性原噬菌体PBSX xkdG

来源： cnki会议评论

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枯草芽胞杆菌BG2036胞外释放DNA现象与其缺陷性原噬菌体PBSX的相...

活性氧响应性硅纳米线阵列促进基因转染的研究

2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会

作者：晋婷婷赵明明王轶唐玮陈向东武汉大学生命科学学院微生物遗传学实验室

PBSX是一种广泛存在于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中的缺陷性原噬菌体,在包装过程中不能正确包裹自身的染色体dna,而是随机包裹一段13kb大小的宿主染色体dna。丝裂霉素C(MMC)可诱导PBSX的大量产生。成熟的PBSX颗粒不能将自身包裹的... 详细信息

PBSX是一种广泛存在于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中的缺陷性原噬菌体,在包装过程中不能正确包裹自身的染色体dna,而是随机包裹一段13kb大小的宿主染色体dna。丝裂霉素C(MMC)可诱导PBSX的大量产生。成熟的PBSX颗粒不能将自身包裹的dna注入细胞,但可通过大量吸附裂解其敏感菌株枯草芽胞杆菌W23。双层平板实验证明PBSX能在其敏感菌株Bacillussubtilis W23菌苔上产生空斑。Bacillus subtilis BG2036的培养液上清与Bacillussubtilis W23菌液混合后,通过测定OD的变化可间接检测Bacillus subtilisBG2036培养液上清中PBSX的相对浓度。据此方法对MMC诱导Bacillus subtilisBG2036产生PBSX的最佳诱导时间进行了探索。Bacillus subtilis BG2036的培养液上清经浓缩,dna纯化后,电泳检测,可观察到约13 kb大小的dna条带。对PBSX的脚手架蛋白基因xkdG进行缺失后,无论是经MMC诱导的还是非诱导的BG2036培养液,其细胞、上清及细胞洗涤液中均检测不到13 kb大小的dna条带。说明xkdG与13 kb dna片段的产生存在一定联系。测定BG2036野生株和突变株的生长曲线,证明xkdG的缺失不会影响BG2036的正常生长。

关键词：枯草芽胞杆菌 dna释放缺陷性原噬菌体PBSX xkdG

来源： cnki会议评论

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活性氧响应性硅纳米线阵列促进基因转染的研究

作者：陆奔奔苏州大学

学位级别：硕士

基因治疗为许多难以医治的疾病提供了十分有效的治疗策略,已经成为人们关注的焦点。然而,作为基因治疗的关键步骤,基因递送需要克服多种细胞内和细胞外的障碍,这给基因载体的开发带来巨大的挑战。基因载体与刺激响应性材料的结合为基因... 详细信息

基因治疗为许多难以医治的疾病提供了十分有效的治疗策略,已经成为人们关注的焦点。然而,作为基因治疗的关键步骤,基因递送需要克服多种细胞内和细胞外的障碍,这给基因载体的开发带来巨大的挑战。基因载体与刺激响应性材料的结合为基因递送的发展提供了有效的解决途径。由于其优异的性质和细胞内广泛存在着的活性氧(ROS)信号,ROS响应性聚合物已被广泛应用于药物递送和基因转染领域。然而,安全高效的ROS响应性药物和基因载体的开发通常受到细胞内ROS浓度的限制。此外,由ROS引发的药物或基因在细胞内完全释放往往需要很长的时间。这些不稳定因素的存在降低了转染效率,限制了ROS响应性载体的应用。因此,设计一种能够稳定细胞内ROS并且快速有效释放基因的ROS响应性载体至关重要。硅纳米线阵列(SN)可以在维持细胞活性的情况下穿刺粘附于其表面的细胞,刺入细胞膜甚至细胞核。考虑到这些特性,SN是一种非常适合于将体外ROS生成系统递送到细胞内的基材。为此,我们设计了一种集ROS生成和响应系统为一体的纳米递送平台(SN-Au-P),用于提升基因转染效率。具体研究内容如下:1.活性氧响应性硅纳米线阵列的制备及其对细胞生长行为的研究。我们首先利用SN自身的还原性在其表面原位还原金纳米粒子制备得到金纳米粒子修饰的SN(SN-Au)。然后通过金硫键的作用将ROS响应性电荷反转阳离子聚合物p-硼酸基苄溴季铵化的聚丙烯酸(N,N-二乙基)氨基乙酯(B-PDEAEA)接枝到SN表面得到SN-Au-P。通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、水接触角测试、核磁共振氢谱和红外光谱等手段确定了金纳米粒子和聚合物在SN表面的成功修饰。利用离子染料染色表征SN-Au-P表面的ROS响应性,结果表明阳离子聚合物修饰的SN表面带有大量的正电荷,表面正电荷密度约为13.59nmol/cm。在1 m M过氧化氢(HO)处理后表面呈负电,发生了电荷反转。同时进一步深入考察了改性的SN表面对细胞生长的影响,结果表明改性的SN表面粘附大量的细胞并且细胞铺展状态良好。细胞死活染色表明改性的SN表面具有良好的细胞相容性,具有被进一步用作基因转染材料平台的潜力和优势。***-Au-P表面促进细胞基因转染效率的研究。基于SN-Au-P表面良好的细胞生长状态及其显著的ROS响应性,我们进一步探讨了SN-Au-P对体外细胞转染的促进作用。由于金纳米粒子和聚合物的引入赋予了SN表面诸多全新的性能,引起SN-Au-P对光和ROS的响应性,同时促进了材料表面的dna的结合与释放。结果表明SN-Au-P/p dna(质粒dna)表面在光照10 min后产生0.71 m M的ROS并且可以直接引起细胞内ROS水平的提升。此外,SN-Au-P表面可结合大量的dna,在1 m M HO处理10 min后约近80%的dna被释放出来。短时间的光照后,SN-Au-P表面对包含较难转染细胞在内的四种不同细胞的基因转染效率均得到不同幅度的提升(人宫颈癌细胞(He La)提升了3.2倍、小鼠成纤维细胞(L929)7.6倍、骨髓间充质干细胞(BMSC)2.3倍和小鼠胚胎干细胞(m ESC)6.2倍),表现出优异的转染能力。综上所述,我们创造性地将ROS响应性聚合物与硅纳米线阵列相结合,制备了集ROS生成和响应为一体的纳米递送平台,实现了对癌细胞和正常细胞包括一些难转染细胞在内多种细胞的高效基因转染。这一平台为药物递送系统提供了一种可行的表面修饰方法,在生物成像和基因转染方面具有应用潜力。

关键词：活性氧响应性硅纳米线阵列金纳米粒子 dna释放基因转染

肝脏各段肝细胞内HBV cccdna和HBV tdna水平分布

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肝脏 2011年第1期16卷 54-56页

作者：郭稳稳江建宁苏明华刘志红梁延秀胡家光葛善飞广西医科大学第一附属医院感染性疾病科 530021 柳州市人民医院柳州市工人医院

HBV感染宿主肝细胞后,HBV基因组进入肝细胞先生产HBV cccdna。然后以HBV cccdna为模板转录装载成HBV rcdna释放入血,对HBV的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义[1]。国内很多文献报道,慢性乙型肝炎病情和乙型肝炎相关性肝癌的发生... 详细信息

HBV感染宿主肝细胞后,HBV基因组进入肝细胞先生产HBV cccdna。然后以HBV cccdna为模板转录装载成HBV rcdna释放入血,对HBV的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义[1]。国内很多文献报道,慢性乙型肝炎病情和乙型肝炎相关性肝癌的发生均与HBV dna的复制有关,

关键词： cccdna HBV感染 dna水平细胞内乙型肝炎相关性肝癌肝脏慢性乙型肝炎 dna释放