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Starburst^(TM) Polyamidoamine Dendrimers介导的绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的表达分布及对恶性疟dna疫苗ES312免疫原性的影响

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中国医学科学院学报 2005年第4期27卷 499-503,i0003页

作者：丁俊军郭晨莹蔡启良蔺亚晖王恒中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所分子寄生虫实验室北京100005 Department of Neurobiology David Geffen School of Medicine at UCLALos AngelesCalifornia

目的研究StarburstTMPolyamidoamine(PAMAM)dendrimers介导绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的表达分布及对恶性疟dna疫苗ES312免疫原性的影响。方法经股四头肌给小鼠注射StarburstTMPAMAMdendrimers与绿色荧光蛋白基因或恶性疟dna疫苗ES312的复合物。通过流式细胞术、Westernblot和间接免疫荧光方法检测绿色荧光蛋白的表达分布和表达量。用ELISA方法检测恶性疟dna疫苗ES312的免疫原性。结果在注射StarburstTMPAMAMdendrimers/dna复合物后2h～7d内,StarburstTMPAMAMdendrimers携带的绿色荧光蛋白基因的表达在小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉中均能被检测到,在肾总蛋白中所占百分比最高,且各器官管腔内皮细胞中的绿色荧光蛋白表达量较高。小鼠的脑和肾中,在StarburstTMPAMAMdendrimers的存在下,绿色荧光蛋白基因的表达量明显高于裸dna的表达量。经StarburstTMPAMAMdendrimers携带的恶性疟dna疫苗ES312诱导的抗体反应水平明显高于单纯裸dna疫苗所诱导的抗体水平。结论StarburstTMPAMAMdendrimers作为一种低抗原性、非病毒的新型dna载体,能够明显提高裸dna在体内的表达水平,诱导产生很强的体液免疫反应。但是,StarburstTMPAMAMdendrimers/dna复合物在各组织器官中的广泛分布,尤其是透过血脑屏障的能力,已超出疫苗载体的适用范围。作为dna疫苗载体,要对现有StarburstTMPAMAMdendrimers分子的结构做进一步的修饰。

关键词： dna转运 Starburst polyamidoamine dendrimers 体内表达免疫原性

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pRNA的结构、功能及其研究近况

遗传 2006年第9期28卷 1180-1184页

作者：周辉卢向阳田云黄成江湖南农业大学生化与发酵工程实验室长沙410128

在噬菌体phi29中,基因组dna的包装需要由病毒基因组编码的pRNA参与,6个pRNA分子通过由pRNA分子间相互作用形成的六聚体来启动dna转运马达,这个过程由ATP提供能量。RNA纳米技术将pRNA与siRNA、核酶、反义RNA等分子稳定结合,pRNA作为一种... 详细信息

在噬菌体phi29中,基因组dna的包装需要由病毒基因组编码的pRNA参与,6个pRNA分子通过由pRNA分子间相互作用形成的六聚体来启动dna转运马达,这个过程由ATP提供能量。RNA纳米技术将pRNA与siRNA、核酶、反义RNA等分子稳定结合,pRNA作为一种载体把它们准确运输到癌细胞和病毒感染细胞的作用靶点,从而发挥它们各自的功能。作为一种非编码RNA,对pRNA的深入研究将有助于我们了解生命起源问题,并有着广阔的应用前景。

关键词： pRNA 六聚体 dna转运纳米粒子

细菌自然转化的分子机制及生物学功能研究进展

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微生物学通报 2019年第7期46卷 1723-1730页

作者：田琇张利刘马峰四川农业大学动物医学院禽病防治中心四川成都611130 四川农业大学动物医学院预防兽医研究所四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

基因的水平转移在细菌的进化中起着非常重要的作用。自然界中的细菌之间主要通过3种机制进行基因水平转移:由噬菌体介导的转导、接合转移和自然转化。自然转化是指自然感受态的细菌能够自发地从外界环境中摄取dna分子并整合到自身基因... 详细信息

基因的水平转移在细菌的进化中起着非常重要的作用。自然界中的细菌之间主要通过3种机制进行基因水平转移:由噬菌体介导的转导、接合转移和自然转化。自然转化是指自然感受态的细菌能够自发地从外界环境中摄取dna分子并整合到自身基因组上的过程。该现象首先发现于肺炎链球菌,目前至少有83种细菌被发现具有发生自然转化的能力,其中革兰氏阳性菌以肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)为代表,革兰氏阴性菌以奈瑟氏菌(Neisseria)为代表,对其自然转化机制的研究和认识较为清楚,但不同细菌之间自然转化的机制有所差异。自然转化的生物学功能一直以来有以下几种推测:获取营养、修复dna损伤、生物进化,而近年来对此认识争论不休。本文将详细描述细菌自然转化的分子机制,并对其主要的生物学功能争论焦点进行评述,以期对细菌自然转化有更深入的理解和认识。

关键词：自然转化 dna转运感受态生物学功能

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穿膜肽介导的新型基因转运载体的研究

穿膜肽介导的新型基因转运载体的研究

作者：张宏达中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

dna疫苗在传染性疾病的防控中有重要的现实意义。但裸dna疫苗对细胞的转染效率低,在体内难以表达抗原基因和递呈抗原蛋白。本研究针对现有dna疫苗的等缺陷,使用穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)与LacI蛋白前头肽突变体(LacI head... 详细信息

dna疫苗在传染性疾病的防控中有重要的现实意义。但裸dna疫苗对细胞的转染效率低,在体内难以表达抗原基因和递呈抗原蛋白。本研究针对现有dna疫苗的等缺陷,使用穿膜肽(Cell-penetrating peptides,CPPs)与LacI蛋白前头肽突变体(LacI headpiece mutant,LacI HPM)融合表达,探讨其作为新型通用性dna转运载体的可行性,为新型dna疫苗载体的研究奠定了前期实验基础。穿膜肽是近年来发现的一些具有高效细胞膜穿透能力的多肽,如HIV-1 TAT,ANTP,VP22等。已经证明蛋白质和dna等外源物质与穿膜肽融合或偶联后,可在不损伤细胞膜的情况下,快速穿过细胞膜进入胞质。并且,这种细胞内的快速运输不受细胞类型的限制。因此,与传统基因载体相比,穿膜肽体内或体外转运dna进入细胞更具优势。本研究使用的穿膜肽分子是ANTP与TAT。ANTP是果蝇触角足蛋白(Drosphila Antennapedia)同源异型结构域中第三个α螺旋,是最早用于转运外源物质进入细胞的穿膜肽分子。TAT来源于HIV-1转录活化因子(HIV-1 Trans-activating transcriptional activator,TAT),是最早发现也是研究最多的穿膜肽分子。 LacI蛋白为大肠杆菌LacI操纵子阻遏蛋白,能够与特异性识别的dna序列(LacI Binding Sequence,LBS)高亲和力结合。LacI蛋白全长357个氨基酸,其dna结合结构域位于LacI蛋白N端1-49个氨基酸残基区域。最近有研究证明,将位于1-62位氨基酸残基的LacI前头肽(LacI headpiece,LacI HP)突变后获得的二聚体具有与LacI蛋白相同甚至更高的特异性dna结合能力。本研究利用PCR方法扩增获得LacI基因序列后,按文献报道,从LacI全长基因中扩增出前头肽,并将其第52位氨基酸残基由缬氨酸突变为半胱氨酸,获得LacI前头肽突变体。突变体中引入的半胱氨酸便于形成二硫键,从而形成二聚体以恢复其与dna的结合能力。同样使用PCR方法获得ANTP和TAT片段。同时,为了提高融合蛋白对细胞的吸附能力,在ANTP和TAT与LacI HPM融合位点间添加了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp,RGD)。将ANTP(-RGD)与TAT(-RGD)片段分别重组至pET-28a(+)质粒中,构建出穿膜肽(-RGD)-LacI HPM原核表达载体。此外,在TAT-LacI HPM片段C端和N端分别添加GST标签,构建了pET-28a(+)-TAT-LacI HPM-GST和pGEX-KG-TAT-LacI HPM重组表达载体。可溶性表达各穿膜肽-LacI HPM融合蛋白并纯化,在缓冲液中氧化获得了穿膜肽-LacI HPM二聚体,使用聚乙二醇(PEG)-8000浓缩后,测定二聚体蛋白溶液浓度。将二聚体融合蛋白与检测质粒体外结合后加入凝胶介质Ni-NTA或谷胱甘肽琼脂糖珠(Glutathione Sepharose 4B)中。蛋白-dna混合物与凝胶介质结合后洗涤,收集每次洗涤后凝胶介质样品。由于检测质粒带有LacI HPM特异性结合序列,因此,通过PCR鉴定出样品中有相应的dna片段存在,初步鉴定了二聚体融合蛋白与检测质粒dna具有特异性和高亲和力结合活性。利用免疫荧光方法检测二聚体融合蛋白是否具有跨膜特性,将融合蛋白TAT-LacI HPM-GST和GST蛋白与细胞共同培养不同时间后,免疫荧光检测穿膜肽-LacI HPM融合蛋白跨膜效果。结果显示融合蛋白二聚体30min左右即可进入细胞,1h左右融合蛋白在细胞内浓度达到峰值,说明融合蛋白二聚体具有跨膜能力。利用增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报道基因,检测穿膜肽-LacI HPM二聚体融合蛋白介导外源基因转染细胞的能力,结果表明在体外与融合蛋白结合的质粒dna能够被介导转运进入细胞。另外,将转染后的细胞裂解,利用免疫印迹进一步证实了转染后细胞中有穿膜肽-LacI HPM融合蛋白的存在。这些结果证明了融合蛋白能够介导带有LBS的dna表达质粒对细胞转染,并在转染细胞中表达了目的外源蛋白。本研究通过借助穿膜肽高效跨膜的特性和LacI HPM高亲结合dna的特性,利用穿膜肽-LacI HPM融合蛋白,证明可以将带有LBS序列的dna片段转运进入细胞,从而期望能够解决传统基因载体的不足,建立一种安全高效、无基因插入片段大小限制的基因转导系统,进而推动dna疫苗的发展和应用。

关键词：穿膜肽 LacI LacI前头肽突变体 dna转运

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穿膜肽介导的新型基因转运载体的功能研究

生物技术通讯 2013年第6期24卷 782-786页

作者：张宏达绳纪坡于芳黄君健胡宝成军事医学科学院生物工程研究所北京100850

目的:借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体(LacI HPM)高亲和力结合dna的特性,建立一种安全高效、无基因插入片段大小限制的基因转导系统。方法:在TAT-LacI HPM片段C端和N端分别添加GST标签,构建pET-28a(+)-TAT-LacI HPM-GST... 详细信息

目的:借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体(LacI HPM)高亲和力结合dna的特性,建立一种安全高效、无基因插入片段大小限制的基因转导系统。方法:在TAT-LacI HPM片段C端和N端分别添加GST标签,构建pET-28a(+)-TAT-LacI HPM-GST和pGEX-GST-TAT-LacI HPM重组表达载体,可溶性表达TAT-LacI HPM-GST及GST-TAT-LacI HPM融合蛋白并纯化,获得TAT-LacI HPM二聚体,免疫荧光检测TAT-LacI HPM融合蛋白穿过HeLa细胞膜的情况,观察EGFP的表达,用免疫印迹检测TAT-LacI HPM融合蛋白介导质粒dna进入细胞的能力。结果:表达、纯化并获得二聚体融合蛋白,体内实验表明其具有跨膜能力,能介导带有LacI结合序列的dna质粒进入细胞,并在转染细胞里检测到了目的蛋白。结论:初步证实TAT-LacI HPM融合蛋白作为一种新型通用性非病毒dna转运载体的可行性,为评价这种新型dna疫苗载体在提高免疫效果方面的可行性奠定了前期实验基础。

关键词：穿膜肽 LacI前头肽突变体二聚体 dna转运