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自动化合成生物技术在dna组装与微生物底盘操作中的应用

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合成生物学 2023年第5期4卷 857-876页

作者：陈永灿司同张建志中国科学院深圳先进技术研究院深圳合成生物学创新研究院中国科学院定量工程生物学重点实验室广东深圳518055

基于绿色生物制造进行物质能量生产,有望减少对天然植被、耕地、石化等资源的依赖,而微生物细胞工厂是绿色生物制造过程的“芯片”。合成生物学为微生物细胞工厂的研究提供了重要的使能技术,但目前仍面临生命系统高度复杂、实验过程需... 详细信息

基于绿色生物制造进行物质能量生产,有望减少对天然植被、耕地、石化等资源的依赖,而微生物细胞工厂是绿色生物制造过程的“芯片”。合成生物学为微生物细胞工厂的研究提供了重要的使能技术,但目前仍面临生命系统高度复杂、实验过程需要反复试错、实验通量较低等限制因素。自动化合成生物技术借助高通量、自动化和智能化的软硬件设施平台,基于标准化、模块化的生物元件库和合成生物工艺,可低成本、高通量、快速、多循环地完成海量工程试错性实验,加速特定性能人工细胞工厂的设计和优化,支撑相关研究和应用。本文主要针对细胞工厂“设计-构建-测试-学习”循环中最关键、最耗时的“构建”环节,对dna组装和底盘细胞操作自动化工艺和设施平台进行了总结,对自动化合成生物技术应用于生物合成基因簇挖掘、代谢通路优化和底盘细胞优化的最新进展进行了介绍。最后展望了微生物细胞工厂自动化构建面临的挑战和未来发展,讨论了包括非模式微生物在内的全流程自动化的发展趋势,而自动化装备的国产化自主研发将为此做出重要贡献。

关键词：细胞工厂快速构建自动化合成生物技术 dna组装底盘细胞操作

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dna组装技术

生物工程学报 2019年第12期35卷 2215-2226页

作者：常汉臣王琛王培霞周见庭李炳志天津大学系统生物工程教育部重点实验室教育部合成生物学前沿科学中心天津300072 天津大学化工学院化学科学与工程协同创新中心天津300072

dna组装是合成生物学研究的核心技术。随着合成生物学的发展,研究者开发了依赖于dna聚合酶或dna连接酶的不同dna组装技术;为了降低组装成本和便于实现dna组装的自动化,也发展了一些非酶依赖的dna组装技术;而几百kb到Mb的大片段dna的组... 详细信息

dna组装是合成生物学研究的核心技术。随着合成生物学的发展,研究者开发了依赖于dna聚合酶或dna连接酶的不同dna组装技术;为了降低组装成本和便于实现dna组装的自动化,也发展了一些非酶依赖的dna组装技术;而几百kb到Mb的大片段dna的组装则多数依赖于微生物体内重组。文中主要综述了酶依赖、非酶依赖和体内同源重组三类dna组装技术及其发展情况。

关键词：合成生物学 dna组装酶依赖同源重组合成

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dna组装新方法的研究进展

生物工程学报 2013年第8期29卷 1113-1122页

作者：李雷芦银华姜卫红中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室上海200032

2010年,蕈状支原体Mycoplasma mycoides的人工合成,迎来了合成生物学的崭新时代。这种突破性的进展主要得益于酵母自身强大的dna体内重组能力。近几年来,除了利用体内重组的dna大片段拼接技术,基于连接或聚合思想的不同尺度的dna体外组... 详细信息

2010年,蕈状支原体Mycoplasma mycoides的人工合成,迎来了合成生物学的崭新时代。这种突破性的进展主要得益于酵母自身强大的dna体内重组能力。近几年来,除了利用体内重组的dna大片段拼接技术,基于连接或聚合思想的不同尺度的dna体外组装方法也相继出现,如Biobrick\Bglbrick、SLIC与Gibson等温一步法等,这些方法的应用加快了合成生物学功能元件库、生物合成途径乃至微生物染色体的人工构建。事实上,目前所建立的各种dna组装方法,均是由dna分子拼接理念(包括两分子衔接思想与多片段组装模式)衍生而来。文中将在介绍dna组装基本理念的基础上,对体内、体外主要的dna组装方法进行简要梳理,希望为不同类型的合成生物学功能器件及生物合成途径的构造提供参考与借鉴。

关键词：合成生物学 dna组装功能器件生物合成途径

利用Gibson dna组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆

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病毒学报 2018年第3期34卷 349-355页

作者：邹小辉夏百成郭小娟王敏鲁茁壮洪涛中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、传染病预防控制国家重点实验室北京100052 潍坊医学院公共卫生与管理学院潍坊261053

为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson dna组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡... 详细信息

为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson dna组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson dna组装反应;反应产物直接转化***感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用Pac I酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒dna,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson dna组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他dna病毒基因组的克隆提供了新思路。

关键词：人5型腺病毒(HAdV-5) Gibson dna组装感染性克隆病毒拯救透射电子显微镜

dna组装效率的无偏差快速检验——基于qPCR而不依赖于转化的方法

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Engineering 2019年第4期 447-462页

作者：马晓焉梁昕鑫霍毅欣 Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy School of Life Science Beijing Institute of Technology UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

合成生物学正朝着大规模、复杂化的方向发展,这在很大程度上依赖于基因模块的高效组装。传统评估dna组装效率(AE)的方法需要进行转化,整个过程耗时长达10 h,而且容易受到各种因素的干扰。为快速、可靠地测定组装效率,本研究建立了一种基... 详细信息

合成生物学正朝着大规模、复杂化的方向发展,这在很大程度上依赖于基因模块的高效组装。传统评估dna组装效率(AE)的方法需要进行转化,整个过程耗时长达10 h,而且容易受到各种因素的干扰。为快速、可靠地测定组装效率,本研究建立了一种基于q PCR的不依赖于转化的测定方法,用连接上的片段占初始加入片段的比例表征组装效率,3 h即可完成测定。利用该方法测定了酶切连接、Golden Gate组装以及Gibson组装法的双片段或多片段组装效率,所得结果与菌落计数法表征的组装效率呈显著正相关。该方法消除了转化过程的随机性,降低了测定偏差,优于传统的菌落计数法。随后,用此方法研究了dna片段末端的二级结构对组装效率的影响。结果显示,所有依赖于末端序列互补的组装技术,其组装效率主要受重叠序列整体性质的影响,而发夹结构可显著降低组装效率。这种基于qPCR的测定方法将促进dna组装技术的发展,并有助于对组装效率影响因素的评估。

关键词：组装效率 dna组装 qPCR 二级结构转化

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酿酒酵母生活史介导的大dna迭代组装技术

酿酒酵母生活史介导的大DNA迭代组装技术

作者：田方方天津大学

学位级别：硕士

dna组装技术是合成生物学的核心使能技术之一。随着生命体设计改造的复杂度与尺度不断提升,亟需更加高效的大片段dna组装技术。大片段dna由于其分子量大、易断裂,使得体外组装方法的组装长度受限,百kb以上的dna一般采用体内组装。然而... 详细信息

dna组装技术是合成生物学的核心使能技术之一。随着生命体设计改造的复杂度与尺度不断提升,亟需更加高效的大片段dna组装技术。大片段dna由于其分子量大、易断裂,使得体外组装方法的组装长度受限,百kb以上的dna一般采用体内组装。然而大片段dna体内组装方法仍面临操作繁琐、阳性克隆数量少的问题。本研究开发了一种酿酒酵母生活史和CRISPR/Cas9系统介导的大片段dna迭代组装技术。该技术将“多轮迭代组装”过程和酿酒酵母生活史的“交配-生孢-拆孢”相结合,通过交配可以在不同交配型的酿酒酵母间直接实现待组装dna片段的高效转移,待组装片段组装正确的二倍体经生孢-拆孢得到单倍体,继续下一轮组装。在此基础上,不同交配型的酿酒酵母发生交配后,体内设计的CRISPR/Cas9系统靶向切割对应质粒上的目标位点,释放出线性dna片段辅助组装,规避了大片段dna体外繁琐低效的操作从而提高体内组装的效率。本研究通过一轮组装验证了不同交配型酵母交配后体内CRISPR/Cas9系统辅助组装的可行性,组装正确的二倍体经减数分裂产生的孢子中含有组装正确的质粒,表明酿酒酵母生活史“交配-生孢-拆孢”过程可以和“多轮迭代组装”结合。以组装酿酒酵母必需基因簇为例验证该方法多轮组装的能力,在不同交配型的酿酒酵母中构建了17个长度分别为10 kb～20 kb的dna片段,每段序列包含5～10个酵母必需基因,采用酿酒酵母生活史介导的大dna迭代组装方法进一步组装。其中7个起始菌株经过三轮迭代过程,成功组装了总长度约108 kb的酿酒酵母必需基因簇质粒(包含30个基因)。每轮组装均获得了大量的菌落(约10个/m L),组装效率在77.78%～100%之间。综上所述,该研究开发了一种结合酵母生活史和CRISPR/Cas9系统的大dna体内多轮迭代组装方法,为大尺度dna的合成生物学研究提供了一种高效易操作的组装工具。

关键词： dna组装 CRISPR/Cas9系统酿酒酵母合成生物学

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合成生物学中的dna组装技术

生命科学 2013年第10期25卷 983-992页

作者：赵鹃王霞李炳志程景胜元英进天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津300072

合成生物学旨在应用工程学的研究思路及手段去设计或改造生物系统,是一个综合了科学与工程的拥有发展潜力的新兴学科,在生物医药、农业、能源、环保等方面发挥着巨大作用。dna组装技术是合成生物学中的关键技术,也是合成生物学快速发展... 详细信息

合成生物学旨在应用工程学的研究思路及手段去设计或改造生物系统,是一个综合了科学与工程的拥有发展潜力的新兴学科,在生物医药、农业、能源、环保等方面发挥着巨大作用。dna组装技术是合成生物学中的关键技术,也是合成生物学快速发展的限制性技术。综述了众多dna组装技术的发展及其在合成生物学研究中的意义和应用。

关键词：合成生物学 dna组装基因合成生物途径构建基因组合成

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基于dna组装体的金纳米阵列构筑

基于DNA组装体的金纳米阵列构筑

中国化学会第十七届全国胶体与界面化学学术会议

作者：马杰张国栋周亭王芳王秀凤张志庆中国石油大学(华东)理学院

脱氧核糖核酸（dna）分子是结构复杂的有机化合物,具有可预测和可编程的分子间相互作用,由此可构筑各种各样的纳米组装体。2006年,Rothemund提出了一种新的dna自组装方法——dna折纸术,将长的单链dna与一系列设计好的dna短片段进行碱基... 详细信息

脱氧核糖核酸（dna）分子是结构复杂的有机化合物,具有可预测和可编程的分子间相互作用,由此可构筑各种各样的纳米组装体。2006年,Rothemund提出了一种新的dna自组装方法——dna折纸术,将长的单链dna与一系列设计好的dna短片段进行碱基互补配对,利用"一锅煮"的方法快速、精准地构建高度复杂的纳米结构。本文设计并构筑了一系列基于dna组装体的金纳米阵列,将两个不同的环状dna模板（均含有63个不同的特定碱基序列）经滚环扩增反应生成两条含有多个重复序列的长链dna（分子量约10000 bp）,进而与42个碱基短链进行碱基互补配对,得到了相较于单条dna长链更具有刚性的dna纳米阵列。借助42个碱基短链的末端巯基,与金纳米颗粒进行结合,实现了纳米金阵列的有序组装。上述结构有望应用于生物传感器、纳米粒子自组装、载药等方面。

关键词：滚环扩增 dna组装金纳米颗粒纳米阵列

来源： cnki会议评论

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利用dna组装结构调控酶级联反应

利用DNA组装结构调控酶级联反应