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极端嗜盐古生菌中dna磷硫酰化修饰系统的研究

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极端嗜盐古生菌中DNA磷硫酰化修饰系统的研究

作者：朱博辰武汉大学

学位级别：硕士

dna磷硫酰化修饰是一种发生在dna双螺旋骨架上的一种修饰,通过将硫原子替代了骨架上非桥连的氧原子而得到。dna磷硫酰化修饰的发现是由于在体外操作具有磷硫酰化修饰的dna进行琼脂糖凝胶电泳时,dna条带发生弥散所致,通过数十年的研究,... 详细信息

dna磷硫酰化修饰是一种发生在dna双螺旋骨架上的一种修饰,通过将硫原子替代了骨架上非桥连的氧原子而得到。dna磷硫酰化修饰的发现是由于在体外操作具有磷硫酰化修饰的dna进行琼脂糖凝胶电泳时,dna条带发生弥散所致,通过数十年的研究,目前确定了 dna磷硫酰化修饰是由dnd基因簇所赋予的,其中dnd基因簇分为两大部分,起到修饰作用的dndACDE,以及起到限制作用的dndFGHI,可能参与到了维持宿主遗传信息稳定性,抵御外来基因入侵,同时磷硫酰化修饰后的dna具有更好的抗氧化能力。由于dna磷硫酰化修饰能赋予宿主一定的抗逆性,因而在原核生物中具有广泛的分布,并且彼此没有的明显亲缘关系且栖息环境相差甚远。因此推测dnd基因簇有可能是通过水平基因转移的方式进行的传播。古生菌作为“三域生命”中重要的一域,同时也属于原核生物。之前通过在古生菌中搜索dnd基因簇并进行序列比对,我们同样发现了在古生菌中也有dnd基因簇的分布,暗示着古生菌中同样可能存在着dna磷硫酰化修饰。古生菌被认为地球上进化最为缓慢的细胞生命,这对于我们研究dna磷硫酰化修饰与原核生物进化过程有着重要的意义。通过实验室先前的工作,我们在耐盐陆生古菌HaloterrigenajeotgaliA29、班戈错湖嗜盐碱红菌Natronorubrumbangense JCM 10635和嗜酸产甲烷古菌Methanoregulaboonei 6A8这三株古生菌中运用LC-MS检测手段对其中可能存在的dna磷硫酰化修饰类型做了检测,并确实发现了dna磷硫酰化修饰的存在。本课题继续利用LC-MS检测手段对极端嗜盐古生菌Halapricum salinum JCM 19729中的dna磷硫酰化修饰的位点进行了测定,发现了在HsalinumJCM 19729中存在d（GpsA）Rp形式的修饰,并对修饰水平进行了精确定量。与此同时,利用最新的单分子实时测序技术——SMRT测序技术,我们对***29以及*** 10635这两株古生菌进行了三代测序,通过SMRT测序,我们确定了这两株古生菌dna磷硫酰化修饰在基因组上的精确分布,并且结合体外甲基化检测甲基化修饰-磷硫酰化修饰双修饰的手段,确定了这两株古生菌的磷硫酰化修饰的核心序列都是5’-GpSATC-3’,同时本研究还致力于探究古生菌之间以及古生菌-细菌之间的dna磷硫酰化修饰系统的水平基因转移,通过将*** A29的dnd基因簇dndCDEA导入到另一株不具备dnd基因簇的极端嗜盐古生菌***7中进行异源表达,发现在导入dnd基因簇以后,会赋予宿主CJ7以dnaPT修饰,第一次在古生菌中完成了dnd基因簇的异源表达。从侧面体现了在古生菌域中同样存在类似细菌中的dnd基因簇的水平基因转移的可能性。在此基础上,通过改造质粒,对古生菌中dnd基因簇进行了精简,发现古生菌A29 dnd基因簇仅需要dndCDE就可以赋予宿主dna PT修饰。并且对导入dnd基因簇的CJ7宿主同样进行了 LC-MS的定量,发现同样存在d（GpsA）p形式的修饰,与来源菌株***29 一致。此外,本课题还对古生菌dnd基因簇在大肠杆菌中的异源表达、古生菌限制相关DndR蛋白的功能分析以及含磷硫酰化修饰古生菌敲除系统的构建进行了初步探索,为磷硫酰化修饰-限制系统的研究提供了更丰富的研究对象,同时也为解析磷硫酰化修饰-限制系统的起源、进化过程、分化动力、对全局基因表达、生命活动的影响及生理意义提供了一个新的方向。

关键词： dna磷硫酰化修饰古生菌甲基化-磷硫酰化双修饰极端嗜盐古生菌转化

古菌中依赖dna磷硫酰化修饰的新型防御系统

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古菌中依赖DNA磷硫酰化修饰的新型防御系统

作者：刘思怡武汉大学

学位级别：硕士

在细菌和古菌中,防御病毒的机制多种多样。而dna磷硫酰化(PT)修饰可以作为防御系统发挥其重要作用,dnd ABCDE-dnd FGH是PT修饰作为防御系统的基因簇,它可以抵御外来没有被PT修饰的dna。但目前为止,有关dna PT修饰的研究并没有在古菌报道... 详细信息

在细菌和古菌中,防御病毒的机制多种多样。而dna磷硫酰化(PT)修饰可以作为防御系统发挥其重要作用,dnd ABCDE-dnd FGH是PT修饰作为防御系统的基因簇,它可以抵御外来没有被PT修饰的dna。但目前为止,有关dna PT修饰的研究并没有在古菌报道,本研究第一次在古菌中鉴定到dna PT修饰,并且找到了一套依赖PT修饰的防御系统。古菌在地球物质循环和能量代谢中有着巨大的作用,而且古菌大多生活在极端的环境下,其胞内的酶和系统具有非常大的应用价值,所以在古菌中研究dna PT修饰以及依赖修饰的防御系统十分重要。本研究首先通过利用细菌的dnd基因簇在NCBI数据库检索到有dnd基因簇存在于古菌中,通过LC-MS/MS分析了五株嗜盐古菌和一株产甲烷古菌的修饰类型,包含d(GA)、d(GG)和d(GA)双修饰,这表明dna PT修饰在古菌中也具有修饰类型的多样性。接着我们通过SMRT测序技术检测四株嗜盐古菌,发现在这几株古菌中PT修饰的核心序列为5’-GATC-3’,并且在古菌中的PT修饰也具有修饰的随机性、不饱和性以及序列特异性等特点。进一步,我们发现在*** A29等古菌的dnd CDEA基因簇周围存在限制相关基因簇pbe ABCD,我们将这些基因成功异源表达到亲缘关系较近的Natrinema ***7-F菌株中。通过病毒SNJ1的侵染,我们发现dnd CDEA-pbe ABCD能够防御古菌病毒的侵染。我们对dnd CDEA-pbe ABCD系统中的八个基因进行分段缺失以及对dnd A进行点突变,确定这套系统中必需的基因以及该系统是依赖于dna PT修饰,而非Dnd蛋白;此外,利用PT修饰病毒SNJ1 dna也可保护病毒不被该系统防御。更近一步的研究,我们发现这套系统通过抑制dna复制来阻止病毒繁殖,且与传统的R-M系统不一样,Dnd CDEA-Pbe ABCD不会降解或裂解病毒dna。通过系统发育学研究发现依赖PT的Pbe ABCD防御系统在古菌和细菌中广泛存在,且这套系统可能通过基因水平转移传播。本课题着重研究古菌中依赖PT修饰的病毒防御系统,Dnd CDEA-Pbe ABCD是一种新型的依赖PT的病毒防御系统,这扩展了已知的防御系统库以及我们对宿主和病毒之间相互作用的了解,同时也将dna PT修饰的研究扩展到古菌的领域,丰富了对dna PT修饰的认识。

关键词：古菌 dna磷硫酰化修饰病毒防御系统

古菌中基于dna磷硫酰化修饰的新型抗病毒系统的研究

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古菌中基于DNA磷硫酰化修饰的新型抗病毒系统的研究

作者：肖瑶武汉大学

学位级别：硕士

dna磷硫酰化修饰是指dna磷酸二酯键上的一个非桥联氧原子被硫原子以R构型取代的dna修饰形式,它的发现首次阐明了dna上的第六种元素“硫”。在前期的研究中,科学家们发现这种dna骨架上的磷硫酰化修饰是由dndABCDE基因簇编码的蛋白所控制... 详细信息

dna磷硫酰化修饰是指dna磷酸二酯键上的一个非桥联氧原子被硫原子以R构型取代的dna修饰形式,它的发现首次阐明了dna上的第六种元素“硫”。在前期的研究中,科学家们发现这种dna骨架上的磷硫酰化修饰是由dndABCDE基因簇编码的蛋白所控制,并且dna磷硫酰化修饰在细菌中广泛存在,具有多样的修饰特征和生理功能。但目前为止,有关dna磷硫酰化修饰的研究均在细菌中展开,本研究首次在古菌中鉴定到dna磷硫酰化修饰的存在,因为古菌是三域生命进化树中重要的一支,所以研究古菌中的dna磷硫酰化修饰就显得尤为必要。本研究首先通过生物信息学分析检索到部分古菌具有dndCDEA基因簇,并且通过LC-MS/MS分别鉴定了其中5株嗜盐古菌,*** JCM10635,*** A29,*** CGMCC 1.10121,*** JCM16811,*** JCM19729,的磷硫酰化修饰类型及频率,修饰类型为d(GA)R,核心序列为5’-GATC-3’。并利用SMRT技术对其中4株古菌中的磷硫酰化修饰进行了精准定位。进一步,我们成功对来自古菌*** A29中的dnd基因簇实现了异源表达,并发现dndCDEA基因簇与其附近的pbeABCD基因簇能够共同组成一套新型的抗病毒系统。我们对dndCDEA-pbeABCD系统进行了分段缺失及关键位点的点突变,确定了这套系统中的必需基因及抗病毒功能依赖于dna磷硫酰化修饰表型的特征。此外,由于古菌*** A29中这套抗病毒系统的磷硫酰化修饰核心序列是5’-GATC-3’,这与Dam甲基转移酶介导的A甲基化修饰的核心序列相同,所以本研究也对古菌中基于dna磷硫酰化修饰的抗病毒系统与甲基化修饰间的关系做了初步探索。本课题致力于古菌中dna磷硫酰化系统的研究,发现来了古菌中的一种基于dna磷硫酰化修饰的新型抗病毒系统,突破了这种修饰系统的相关研究仅局限在细菌域的瓶颈,拓展了对dna磷硫酰化这一表观修饰生理意义的认识,丰富了我们对限制修饰系统的认知。

关键词： dna磷硫酰化修饰嗜盐古菌限制修饰系统

奇异变形杆菌1166中SBDHNH蛋白与dna磷硫酰化修饰共存现象的探究

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奇异变形杆菌1166中SBDHNH蛋白与DNA磷硫酰化修饰共存现象的探究

作者：邢买武汉大学

学位级别：硕士

dna磷硫酰化(Phosphorothioation,PT)修饰是天然发生的广泛分布在细菌和古菌中的一种新型表观遗传学修饰,其化学本质是硫原子取代dna脱氧核糖-磷酸骨架上非桥连的氧原子,并具有序列选择性和R构型特异性。迄今为止,已经发现的PT修饰系统... 详细信息

dna磷硫酰化(Phosphorothioation,PT)修饰是天然发生的广泛分布在细菌和古菌中的一种新型表观遗传学修饰,其化学本质是硫原子取代dna脱氧核糖-磷酸骨架上非桥连的氧原子,并具有序列选择性和R构型特异性。迄今为止,已经发现的PT修饰系统包括两类,一类是由dnd ABCDE基因簇的表达产物所赋予的发生在dna的双链上的修饰,另一类是由ssp ABCD基因簇的表达产物所赋予的发生在dna单链上的修饰。由Dnd ABCDE蛋白赋予的PT修饰单独存在时称为孤儿磷硫酰化修饰,Dnd ABCDE蛋白与其同源限制酶Dnd FGH同时存在时可构成一套限制-修饰(restriction-modification,R-M)系统,保护细胞免受外来非PT-dna的入侵,以维持自身遗传信息的稳定性;由Ssp ABCD蛋白赋予的PT修饰可以与同源Ssp E蛋白组成一套新的PT敏感的细菌防御系统,具有广泛的抗噬菌体活性。dna修饰通常被编码修饰生物学功能的特定蛋白质所识别,仅识别被修饰的底物dna并对其进行限制性切割的特定蛋白质称为修饰依赖的限制性核酸酶(Modification dependent restriction endonucleases,MDREs),融合型的MDREs由识别特定修饰结构域及催化结构域组成。SBD为近期揭示的特异性识别并结合PT修饰中的R构型的硫的结构域。本课题选取奇异变形杆菌1166(Proteus mirabilis 1166＿PMIR)为研究对象,分析其基因组序列发现该菌具有sbdhnh基因及PT修饰基因簇dnd BCDE且二者相距较近,LC-MS/MS检测发现其PT修饰类型为d(GA)/d(GT),推测其修饰核心序列为5’-GAAC-3’/5’-GTTC-3’。体内实验发现SBDHNH可以识别四种共有序列模式的PT修饰:5’-GAAC-3’/5’-GTTC-3’、5’-GATC-3’/5’-GATC3’、5’-GGCC-3’/5’-GGCC-3’及5’-CCA-3’,表现为在异源表达情况下,当SBDHNH分别与含这四种序列模式的PT修饰共存且诱导SBDHNH表达时,会导致宿主菌的生长受抑制或不生长。同时,逆转录-PCR结果表明在*** 1166中,常规培养条件下sbdhnh几乎不表达,这与其菌株内dnd基因簇和sbdhnh基因共存的现象相吻合。对SBDHNH进行关键位点突变及部分序列同框缺失,确定了SBD为识别PT修饰的关键结构域。此外,在*** 1166中具有完整的PT限制-修饰系统Dnd BCDE-Dnd FGHI,噬菌体侵染实验表明这套系统可以组成R-M系统,抵抗外源非PT-dna的入侵。为探究SBDHNH蛋白与PT修饰共存的生理意义,我们将来自*** 1166的SBDHNH与PT系统异源共表达在同一宿主菌中,并对其进行抗病毒功能研究,结果未显示出SBDHNH蛋白与PT蛋白共存具有明显的抗病毒协同作用。

关键词： dna磷硫酰化修饰奇异变形杆菌硫结合结构域抗病毒系统

Ⅱ型dna磷硫酰化修饰系统中SspE结构生物学的研究

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Ⅱ型DNA磷硫酰化修饰系统中SspE结构生物学的研究

作者：张玉冰武汉大学

学位级别：硕士

dna磷硫酰化修饰是发生在dna骨架上的,由硫原子取代磷酸二酯键上的非桥连氧原子所形成的一种新型修饰类型。是由基因簇dndABCDE对双链上特定的序列进行修饰并以专一的R空间构型存在,这种修饰在细菌和古菌中普遍存在。随后的研究表明,在... 详细信息

dna磷硫酰化修饰是发生在dna骨架上的,由硫原子取代磷酸二酯键上的非桥连氧原子所形成的一种新型修饰类型。是由基因簇dndABCDE对双链上特定的序列进行修饰并以专一的R空间构型存在,这种修饰在细菌和古菌中普遍存在。随后的研究表明,在该修饰基因簇下游存在反向的由dndFGH组成的限制基因,共同组成限制修饰系统维护宿主菌的基因完整性。随着研究的不断深入,在Vibrio cyclitrophicus FF75中发现另一种由sspABCD基因簇负责的单链CC修饰类型,称为Ⅱ型dna磷硫酰化修饰。对*** FF75的进一步研究发现当缺失了修饰基因簇后,原本能在低温4℃下生长的菌株却不能在15℃下正常生长。进一步发现这种现象是由位于修饰基因下游的sspE基因引起,即sspE可以赋予弧菌磷硫酰化修饰基因突变株低温生长抑制。但对于该基因的作用机制以及所编码蛋白的功能仍然需要进一步的研究探索。本研究主要围绕Ⅱ型dna磷硫酰化修饰中SspE蛋白表达、纯化和结晶展开,致力于获得蛋白的三维立体结构,为后续研究其生理活性奠定理论基础。最初为了纯化*** FF75的SspE蛋白,但其大部分都是以包涵体的形式存在,这不利于后续的纯化点晶工作。因此用与FF75同源性较高的Streptomyces yokosukanensis DSM 40224的SspE蛋白代替,最终经过优化筛选我们得到了X射线衍射分辨率为3.3?的野生型和硒代的SspE蛋白晶体,用单波长反常散射法来定相位,但由于分辨率太低,最终我们只得到了SspE蛋白的N端1-327 AA部分的晶体结构,C端部分只能看到蛋白序列主链信息,侧链的功能基团没有解析出来。对于全长的SspE蛋白晶体的优化仍在进行中。

关键词： dna磷硫酰化修饰 SspE蛋白晶体结构

CRISPR-Cas系统与dna磷硫酰化限制—修饰系统间相互作用的研究

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CRISPR-Cas系统与DNA磷硫酰化限制—修饰系统间相互作用的研究

作者：刘长珍武汉大学

学位级别：硕士

在微生物的世界里,细菌与古菌时刻面临病毒或外源质粒等移动基因原件的威胁,因此它们进化出了多种多样的防御策略以保护自身遗传稳定。近年来所发现的dna磷硫酰化限制-修饰系统便隶属于一种新型的天然型免疫防御系统,其由dnd ABCDE基因... 详细信息

在微生物的世界里,细菌与古菌时刻面临病毒或外源质粒等移动基因原件的威胁,因此它们进化出了多种多样的防御策略以保护自身遗传稳定。近年来所发现的dna磷硫酰化限制-修饰系统便隶属于一种新型的天然型免疫防御系统,其由dnd ABCDE基因簇编码的修饰蛋白与其下游的dnd FGH基因簇或pbe ABCD基因簇编码的限制蛋白组成。与之相反,CRISPR-Cas系统通过将外源核酸序列记忆整合至自身基因组后才发挥防御作用,因此被称为获得型免疫系统。通过生物信息学的分析结果,这两套系统广泛分布于各类细菌与古菌中,为其宿主提供保护。而且在一些细菌的基因组中同时存在着编码这两套系统的基因簇。那么,这两套系统的共存,在功能上是否存在着相互影响,本文便着手解答这一问题。本研究使用的Salmonella enterica serovar Cerro 87同时具有一套由dnd BCDE-dnd FGH构成的Dnd限制-修饰系统以及I-E型CRISPR-Cas系统。而通过质粒转化实验,我们证实其内源CRISPR-Cas系统不具备靶向切割活性。所以我们转而采用机制研究较为清晰的来源自Streptococcus pyogenes中Ⅱ-A型高效CRISPR-Cas系统来进行试验。通过噬菌体成斑效率(EOP)实验我们发现,单独的Dnd限制-修饰系统可以将噬菌体侵染能力降低10倍,而CRISPR-Cas系统的防御能力因其spacer不同而存在差异(10倍)。进一步,我们发现这两套系统可以共存于同一个宿主中,并且发挥协同作用,提高宿主整体防御水平,最高可以达到10倍,超过单个系统作用效率约10倍。另一方面,通过Cas9核酸酶体外切割实验,我们设计了不同磷硫酰化修饰状态的三种dna底物,在相同条件下,进行Cas9蛋白处理。我们发现修饰后的dna并不会明显抑制Cas9的切割活性,这暗示着双系统协同作用可能是由于逃逸了Dnd限制-修饰系统的噬菌体仍会被CRISPR-Cas系统切割所致。本研究着眼于天然型防御系统Dnd限制-修饰系统与获得性防御系统CRISPR-Cas之间的相互关系,突破了两种防御系统独立行使功能的认知,显示出细菌防御系统的多样性与复杂性,也从侧面体现了细菌与病毒之间亿万年共同进化的理论。

关键词：相互作用 dna磷硫酰化修饰 CRISPR-Cas系统

灭癌素链霉菌中磷硫酰化修饰dna结合结构域的功能分析

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微生物学报 2022年第2期62卷 543-555页

作者：陈英孔令新邓子新由德林上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200030

【目的】dna磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代dna骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型dna修饰。PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示。PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长... 详细信息

【目的】dna磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代dna骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型dna修饰。PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示。PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成为新PT检测方法开发的优选。灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)中具有天蓝色链霉菌中PT修饰依赖的IV型限制酶(ScoMcrA)的同源酶,暗示其同样含有特异性结合PT修饰dna的硫结合结构域(sulfur binding domain,SBD)。本文对灭癌素链霉菌中的SBD(简称为Sg-SBD)与PT修饰dna的亲和力进行定性检测与定量表征,评估其用于PT修饰ELISA方法开发的潜力。【方法】对ScoMcrA-SBD和Sg-SBD的氨基酸序列进行比对分析,利用ScoMcrA-SBD为模板进行同源建模。在大肠杆菌中异源表达Sg-SBD,利用纯化的Sg-SBD进行凝胶迁移(electrophoresis mobility shift assays,EMSA)检测。利用生物膜层干涉(biolayer interferometry,BLI)技术进行Sg-SBD结合PT修饰dna的定量表征。【结果】生物信息学分析揭示了Sg-SBD含有结合硫原子的保守的氨基酸残基,同时表明Sg-SBD具有与ScoMcrA-SBD相似的结构。EMSA实验发现Sg-SBD可以结合PT修饰dna形成明显的迁移带,初步证实Sg-SBD结合PT修饰dna的活性。BLI数据显示,Sg-SBD具有比ScoMcrA-SBD更强的PT修饰dna结合能力,其与PT修饰dna的亲和力常数在nmol/L级别,并且Sg-SBD不结合非PT修饰dna。【结论】Sg-SBD结合PT修饰dna活性接近抗原-抗体的反应水平,可用于PT修饰dnaELISA快速检测方法的开发。

关键词： dna磷硫酰化修饰硫结合结构域凝胶迁移生物膜层干涉酶联免疫检测

基因组磷硫酰化修饰的生理功能及双修饰系统研究

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基因组磷硫酰化修饰的生理功能及双修饰系统研究

作者：张清华曲阜师范大学

学位级别：硕士

作为生命体的基本遗传物质,dna大分子及其表观遗传修饰一直是生命科学领域的研究热点之一。其中,dna磷硫酰化(Phosphorothioate,PT)修饰,即硫原子取代dna骨架磷原子上的非桥联氧原子,是目前唯一已知的发生在dna骨架上的天然修饰。PT修饰... 详细信息

作为生命体的基本遗传物质,dna大分子及其表观遗传修饰一直是生命科学领域的研究热点之一。其中,dna磷硫酰化(Phosphorothioate,PT)修饰,即硫原子取代dna骨架磷原子上的非桥联氧原子,是目前唯一已知的发生在dna骨架上的天然修饰。PT修饰以Rp构象广泛存在于原核生物中,包括多种人类致病菌以及肠道微生物。目前,PT这一新型表观遗传修饰的生理学功能、作用机制、合成代谢等诸多科学问题尚未得到充分阐明。本研究针对PT修饰依赖的限制系统的作用机理,建立了一种dna断裂损伤鉴定方法。发现dna磷硫酰化修饰限制系统中PT修饰敲除表型较野生型和PT修饰限制双敲除菌株产生了50,000多个特征位点并发现腺苷酸(AA)之间的dna断裂热点。为了阐明PT修饰对宿主菌在不同环境中的生理学影响,本研究开发了一种基于荧光蛋白标记的细菌竞争性共生长平台。研究发现:1)在氧化压力下,Na Cl O(Cl O)处理的含PT修饰(PT+)菌株较修饰缺失突变株(PT-)对氧化胁迫有更高的敏感度;2)营养竞争压力下,PT+菌株前期处于生长弱势,然而该压力维持三天后PT+菌株获得了新的生长优势;3)温度胁迫压力下,大肠杆菌PT+菌株表现出对高温更强的耐受能力;4)小鼠肠道微生物竞争定植模型中,PT+菌株在定植和生长中均表现弱的生长活性,造成宿主鼠肠道溃烂并在器官间转移。为阐明PT修饰的动态过程以及丰度稳定的生理学意义,本研究还以最新发现的恶臭假单胞菌*** S1的PT修饰系统为基础描绘了S1菌株的基因组dna PT修饰图谱。发现其具有部分修饰特征,其修饰保守序列为5’-Gps ATC-3’,占基因组总GATC的7.33%,呈dna单链分布并主要发生在蛋白质编码区。另一方面,本研究还在S1菌株中引入了另外一种不同类型的PT修饰,实现了5’-Gps ATC-3’和5’-Gps GCC-3’双修饰系统的构建。研究发现,该双系统中,5’-Gps ATC-3’与5’-Gps GCC-3’的修饰位点数目比例为1:2.92;5’-Gps ATC-3’修饰位点较单修饰系统下降了59%;注释其PT修饰位点所处功能区域,发现95个CDS区的PT修饰丰度上调。本研究还对该双修饰系统进行转录组测序分析和生理学分析。差异表达基因中,双修饰系统中出现了251个基因的表达上调,主要为有机酸代谢、核苷酸或小分子结合相关基因;同时出现了398个基因表达下调,主要为细胞膜组成相关基因。在生理活性方面,S1双修饰系统对氧化剂表现出更高的敏感性,进一步证实基因组dna上的PT修饰赋予了宿主菌氧化劣势,降低了基因组稳定性。综上,本研究以基因组dna上的磷硫酰化修饰为研究对象:1)通过构建dna损伤位点检测方法,明确了PT限制系统损伤热点及损伤频率;2)通过建立共培养系统,阐明了不同条件下PT修饰对于宿主菌的生理学意义;3)研究了PT修饰菌株在小鼠肠道中的定植能力和生长状态;4)鉴定了一株恶臭假单胞菌中PT修饰基因组图谱并描绘其分布特征;5)构建了dna PT双修饰表达系统,并阐明了两种不同PT修饰在基因组上的分布特征以及相互作用;6)阐明了PT双修饰系统对宿主菌转录组的影响,揭示了PT修饰表观调控网络。本研究对PT修饰这一新型表观修饰的生理学功能、表观遗传调控机理、生物合成途径等进行了全面解析,加深了对PT修饰的理解和认知;建立的多个技术平台将为PT修饰的深入研究,尤其是对肠道微生物中广泛分布的PT修饰,奠定了技术基础并初步提供理论指导和科学依据。

关键词： dna表观遗传修饰 dna磷硫酰化修饰基因组修饰图谱双修饰系统序列特异性修饰丰度转录组测序质谱分析

沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化

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微生物学报 2013年第10期53卷 1111-1116页

作者：安贤惠周秀芬汪志军邓子新梁晶丹淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室连云港222005 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】细菌dna磷硫酰化修饰是指dna骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被... 详细信息

【目的】细菌dna磷硫酰化修饰是指dna骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE。本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC在dna磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础。【方法】以沙门氏菌总dna为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaI和XhoI位点之间,构建融合表达载体pJTU3622;将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆;提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主[*** BL21(DE3)pLysS],获得工程菌株Anxh103;优化表达条件,诱导表达dptC基因;采用GST-Trap柱和kata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白。【结果】获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxh103;确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8-18 h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50μmol/L Fe2+。【结论】成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达;表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础;沙门氏菌DptC发酵体系中添加50μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe-4S的铁硫蛋白。

关键词： dna磷硫酰化修饰 Salmonella enterica dpt基因簇基因克隆与表达蛋白质的分离纯化