检索结果-南通市图书馆

作者：徐洪涛南京农业大学

学位级别：硕士

本研究以成年健康雄性牦牛和犏牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆筛选Boule基因的选择性剪接体,对基因序列及其编码的蛋白质结构和功能进行分析,实时荧光定量PCR技术检测Boule基因的选择性剪接体在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平并且运... 详细信息

本研究以成年健康雄性牦牛和犏牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆筛选Boule基因的选择性剪接体,对基因序列及其编码的蛋白质结构和功能进行分析,实时荧光定量PCR技术检测Boule基因的选择性剪接体在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平并且运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得牦牛睾丸组织Boule基因差异甲基化区(DMR)序列,运用亚硫酸氢钠测序法检测了该基因基因DMR甲基化状态,为研究犏牛雄性不育与dna甲基化的关系提供理论基础。 1Boule基因选择性剪接体的克隆筛选本试验根据黄牛Boule基因序列(NM01102115)设计两对引物,采用RT-PCR技术着重对Boule基因的开放阅读框进行扩增,结果第一对引物扩增出两条序列长分别为802bp和766bp,第二对引物扩增出的序列长362bp,序列拼接后为两条序列：1037bp、1001bp,GenBank登录号分别为：GU187434;GU187435。对这两条序列进行分析,我们找到了标准的"GT"、"AG"位点,严格遵循"GT-AG"剪接规则。因此我们可以断定这两条序列为Boule基因的两条选择性剪接体,分别命名为Boulel、 Boule2。 2Boulel、Boule2核苷酸及蛋白序列的生物信息学分析分析借助生物信息学网络资源和相关生物学软件,筛选出的Boulel(?)勺开放阅读框长849bp,跟正常序列相比缺失了外显子3的5’端36bp碱基,从而导致开放阅读框少了12个氨基酸残基,氨基酸比对发现剪接部位位于RRM结构域内,但是没有影响到RNP1、RNP2区域,Boule基因的Reapt区域未发生剪接;Boule2的开放阅读框长813bp,跟正常序列相比缺失了外显子3的5’端72个bp碱基,从而导致开放阅读框少了24个氨基酸残基,氨基酸比对发现在RRM区域没有发生剪接,选择性剪接发上在Boule基因的Reapt区域。对两者的蛋白分析发现,Boulel比Boule2少一个α螺旋,它们的RRM三维结构也证实了这一点,推测Boulel与雄性不育有着密切的关系。 3牦牛和犏牛睾丸组织中Boulel、Boule2的mRNA表达水平利用Real-time PCR技术对牦牛和犏牛睾丸组织中Boulel、Boule2的mRNA的表达进行定量分析,结果表明牦牛睾丸组织中剪接体Boulel的mRNA表达量高而犏牛的表达量低,其中犏牛与牦牛的表达量差异极显著(P0.05)。 4牦牛Boule基因5’端CpG岛的分子克隆及序列分析本实验根据黄牛Boule基因序列(NW001494657.1)设计引物扩增了牦牛Boule基因的5’端序列,并对牦牛、黄牛和犏牛Boule基因的甲基化水平进行了分析,结果发现：牦牛Boule基因的5’端存在CpG岛,CpG岛长2000bp,包含启动子区、第一外显子和第一内含子;犏牛Boule5’端dna甲基化水平(17.5%)极显著高于黄牛(5.2%)和牦牛(7.0%)(P甲基化与其mRNA表达缺乏、雄性不育的表型是一致的,说明Boule基因的甲基化对Boule基因mRNA的表达调控起重要作用,可能对犏牛生精细胞减数分裂、雄性不育有重要影响。

关键词：牦牛 Boule选择性剪接体序列分析 Real-time PCR 雄性不育 dna甲基化分析

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基于dna甲基化测序技术研究青蒿琥酯干预脑胶质瘤的分子机制

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中草药 2023年第6期54卷 1814-1824页

作者：闫向英毛霞李涛 Koji Mizuno Katsuki Okuyama 林娜张彦琼 Takashi Sato 中国中医科学院中药研究所北京100700 东京药科大学生物化学系东京192-0392

目的探究青蒿琥酯干预胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的药效及其潜在分子机制。方法采用Cell TiterBlue检测青蒿琥酯对U87和U2512种人源胶质母细胞瘤细胞活性和增殖的影响;流式细胞术检测青蒿琥酯对2种细胞周期的调节作用;采用q RT-PCR... 详细信息

目的探究青蒿琥酯干预胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的药效及其潜在分子机制。方法采用Cell TiterBlue检测青蒿琥酯对U87和U2512种人源胶质母细胞瘤细胞活性和增殖的影响;流式细胞术检测青蒿琥酯对2种细胞周期的调节作用;采用q RT-PCR和Western blotting检测青蒿琥酯对2种细胞自噬水平的影响。采用dna甲基化联合网络药理学从表观遗传学层面研究青蒿琥酯干预GBM的靶标基因,并建立蛋白质-蛋白质相互作用网络,通过计算网络中各节点的网络拓扑特征值,筛选出青蒿琥酯干预GBM的核心靶点并进行生物功能富集分析;采用AutoDock v4.2.6和Auto Dock Vina v1.2.0软件开展分子对接虚拟计算,考察青蒿琥酯与其候选关键靶点的结合能力,并采用Western blotting验证青蒿琥酯对2种脑胶质瘤细胞中关键靶点表达的影响。结果青蒿琥酯可显著抑制U87细胞的活性和增殖(Pdna甲基化测序与网络药理学整合分析,在获得青蒿琥酯敏感型和耐药型脑胶质瘤细胞的差异基因集,以及青蒿琥酯干预2种细胞效应基因集的基础上,发现其干预2类脑胶质瘤细胞的关键网络靶标共同参与GBM恶性进展密切相关的血小板衍生生长因子受体α(platelet derived growth factor receptorα,PDGFRA)-大鼠肉瘤基因(rat sarcoma viral oncogene homolog,RAS)-B-Raf原癌基因(B-Raf proto-oncogene,BRAF)-丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogenactivated protein kinase kinase,MEK)-细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)通路,且青蒿琥酯与其直接靶标(PDGFRA、BRAF)具有较强的亲和力。Western blotting实验证实青蒿琥酯可以抑制U87和U251细胞中关键靶点PDGFRA和BRAF蛋白的表达(P<0.05、0.01、0.001)。结论青蒿琥酯可能通过靶向调控PDGFRA-RAS-BRAF-MEKERK信号通路,从而抑制GBM细胞的生长和扩散,为青蒿琥酯治疗GBM提供了体外实验依据,也为解决临床抗肿瘤药物的耐药问题提供了新思路和新方法。

关键词：青蒿琥酯胶质母细胞瘤 dna甲基化分析耐药 PDGFRA-RAS-BRAF-MEK-ERK信号通路

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