检索结果-南通市图书馆

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源dna残留量检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2020年第3期33卷 308-311,315页

作者：杨萍张艳李微刘大维闫慧褚彦飞白鹭谷铁军孙博吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室吉林长春130012 吉林大学生命科学学院吉林长春130012 长春百克生物科技股份公司吉林长春130012

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主dna残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组dna,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp... 详细信息

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主dna残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组dna,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组dna超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主dna残留量进行测定。结果纯化后dna样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp dna超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞dna残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。

关键词：地高辛探针杂交 dna残留昆虫细胞重组人肠道病毒71型病毒样颗粒

沙培体系下植物和生物质炭对胞外dna残留的影响

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南京工业大学学报（自然科学版） 2019年第5期41卷 632-637页

作者：梁颖赵维生弘杰付玉豪王心情王芳南京工业大学环境科学与工程学院江苏南京211800 中国科学院南京土壤研究所土壤环境与污染修复重点实验室江苏南京210008

为了研究植物和生物质炭对抗性dna在土壤中残留变化的影响,采用沙培生菜盆栽实验,以小牛胸腺dna为模拟抗性dna,测定在栽培生菜和添加玉米秸秆炭处理中dna的含量随时间的变化。结果表明:沙培期间,所有处理(对照、生菜栽培、添加玉米秸秆... 详细信息

为了研究植物和生物质炭对抗性dna在土壤中残留变化的影响,采用沙培生菜盆栽实验,以小牛胸腺dna为模拟抗性dna,测定在栽培生菜和添加玉米秸秆炭处理中dna的含量随时间的变化。结果表明:沙培期间,所有处理(对照、生菜栽培、添加玉米秸秆炭、生菜玉米秸秆炭联合处理)中,dna的含量均呈先快速下降,之后趋于平稳的趋势。相比对照,种植生菜使dna在快速减少后小幅增加,仅添加生物质炭的处理在培养期间dna含量均低于对照。植物可能通过根系影响微生物量增加dna,玉米秸秆炭可能通过吸附作用减小dna的含量,种植生菜或添加玉米秸秆炭减缓dna降解速率的机制可能不同。该结果为抗性dna和抗性基因在土壤植物中迁移和传播阻控研究提供了采样时间的依据,有利于科学评价抗性基因迁移风险,但植物和玉米秸秆炭对dna变化的影响和机制需进一步研究。

关键词：盆栽植物生物质炭 dna残留抗性基因

实时荧光定量PCR法检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌dna残留量

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中国现代应用药学 2018年第8期35卷 1158-1161页

作者：李炎陈捷蒋佳兴王叔桥四川省食品药品检验检测院成都611731

目的建立可定量检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌dna残留量的实时荧光定量PCR方法。方法采用宿主细胞残留dna样本前处理试剂盒(磁珠法)提取毕赤酵母菌dna,利用毕赤酵母残留dna检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增反应,绘制标准曲线... 详细信息

目的建立可定量检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌dna残留量的实时荧光定量PCR方法。方法采用宿主细胞残留dna样本前处理试剂盒(磁珠法)提取毕赤酵母菌dna,利用毕赤酵母残留dna检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增反应,绘制标准曲线,建立毕赤酵母菌dna残留量的Real-time PCR检测方法,并验证其准确性和精密性。结果毕赤酵母菌dna质量浓度在0.03~300 pg·μL-(16)内线性良好(r>0.99),定量限为0.03 pg·μL-(16);应用该法对3批门冬氨酸鸟氨酸原料药进行测定,毕赤酵母菌dna残留量均远低于每剂10 ng。结论该方法可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌dna残留量的定量测定。

关键词：门冬氨酸鸟氨酸毕赤酵母菌 dna残留实时荧光定量PCR

CAR-T生产中病毒载体dna残留检测方法的建立和优化

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CAR-T生产中病毒载体DNA残留检测方法的建立和优化

作者：凤晓锋上海交通大学

学位级别：硕士

运用CAR T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)治疗肿瘤的方法是近年来发展最为迅速的一种肿瘤免疫新疗法。CAR T细胞疗法能克服局部免疫抑制,对肿瘤细胞的杀伤不受MHC(major histocompatibili... 详细信息

运用CAR T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)治疗肿瘤的方法是近年来发展最为迅速的一种肿瘤免疫新疗法。CAR T细胞疗法能克服局部免疫抑制,对肿瘤细胞的杀伤不受MHC(major histocompatibility complex)限制等优势,但同时也必须面对在治疗过程中产生的细胞因子释放综合症(CRS)、脱靶效应和神经毒性等因素的困扰。因此CAR T细胞治疗技术的有效性和安全性还需要研究人员去严格把控。由于CAR T生产过程中细胞培养环境的多样性使得CAR T产品中的杂质复杂多样,即使微量的杂质残留都可能会在人体中产生严重的免疫反应,其中dna残留是最主要的杂质。残留的外源dna可能造成插入突变、导致抑癌基因失活、癌基因被激活等,而至今还没有一种全面、准确、合规的检测方法能评价CAR T中间产品—慢病毒载体中的dna残留。因此本文将采用荧光染料法和qPCR法对慢病毒载体生产和纯化工艺中的样品进行dna残留检测。PicoGreen荧光染料法检测dna残留具有检测快速、成本低的特点,但其灵敏度不高,对于特定dna残留如SV40和E1A等也缺乏有效的检测方法,而qPCR法虽具备特异性强、灵敏度高的特点,却存在只能检测宿主细胞(CHO、Ecoli、Vero),不能检测293T细胞总dna残留的缺点。为了能更好的完善CAR T生产纯化工艺,全面检测慢病毒载体中的dna残留,为将来CAR T技术更好地运用于临床实验当中去。本文先运用荧光染料法建立了三套不同的检测范围和灵敏度的总dna残留检测方法,并针对于实际慢病毒载体生产样品的浓度,选取2500 ng/mL检测范围的检测方法进行准确度、精密度、专属性、稀释线性和耐用性的验证。随后运用qPCR法通过探针引物的选择、优化,dna抽提效率的考察后建立了针对于SV40、E1A dna残留检测的方法,并对这两种方法进行了准确度、精密度、专属性、和耐用性的验证,通过联合运用荧光染料法和qPCR法对慢病毒载体中的dna残留进行全面、准确、快速、高效的检测。

关键词： CAR T 慢病毒载体 dna残留荧光染料法 qPCR法

口服六价重配轮状病毒减毒活疫苗（Vero细胞）dna残留检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2024年第12期37卷 1505-1511页

作者：刘艳何鹏李娟娟申瑷琳肖瑶彭小欢郭旭梦姚瑞宁胡忠玉施金荣中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室武汉生物制品研究所有限责任公司

目的利用磁珠分离法结合荧光染色法，建立口服六价重配轮状病毒（rotavirus,RV）减毒活疫苗（Vero细胞）原液及成品中dna残留量的检测方法，并进行验证。方法采用宿主细胞残留dna样本前处理试剂盒（磁珠法）提取样品中的残留Vero细胞... 详细信息

目的利用磁珠分离法结合荧光染色法，建立口服六价重配轮状病毒（rotavirus,RV）减毒活疫苗（Vero细胞）原液及成品中dna残留量的检测方法，并进行验证。方法采用宿主细胞残留dna样本前处理试剂盒（磁珠法）提取样品中的残留Vero细胞dna，再利用荧光染色对样品中残留dna进行测定，采用直线回归拟合标准曲线并对样品中的dna残留量进行分析。对建立的方法进行线性范围、精密度、准确度、专属性、耐用性、定量限验证。对6个血清型的单价原液和成品中的残留宿主细胞dna进行测定，并采用3种不同方法（荧光染色法、qPCR法、分子杂交法）进行检测，比较检测结果的一致性。结果该方法检测口服六价重配RV减毒活疫苗（Vero细胞）dna残留量的定量限为1.25 ng/mL，标准品浓度在1.25～80 ng/mL范围内线性关系良好，线性相关系数（r）为1.00；单价原液重复检测6次的加标回收率在93.8%～132.1%之间，成品重复检测6次的加标回收率在66.0%～90.0%之间；同一人员对单价原液和成品重复检测6次的相对标准差（relative standard deviation,RSD）在5.5%～16.1%之间，不同人员对单价原液和成品重复检测6次的RSD分别为7.7%和15.6%；用干扰溶液与RNase-free Water分别稀释标准品至25μg/mL,Vero细胞dna残留量检测结果的回收率在98.0%～138.8%之间，RSD dna残留量检测结果的RSD dna残留的含量测定，同时也可作为工艺过程中对中间品等关键步骤的评价手段。

关键词： dna残留荧光染色法磁珠分离法 Vero细胞轮状病毒

磁珠法结合定量PCR检测肠道病毒71型灭活疫苗中宿主细胞dna残留量的验证及应用

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国际生物制品学杂志 2018年第3期41卷 123-127页

作者：张静静宋路萍安文琪马小伟梁雪爽郭冰峰荆新蕊马超援张少宁毕利利王斌华兰生物工程股份有限公司研发中心新乡453000

目的对磁珠法结合定量PCR（quantitative PCR，qPCR）检测肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）（EV71疫苗）中宿主dna残留量进行适用性验证及应用。方法利用微磁珠与蛋白溶液中dna的特异性结合，来提取样品中残留的宿主细胞dna。将已知浓... 详细信息

目的对磁珠法结合定量PCR（quantitative PCR，qPCR）检测肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）（EV71疫苗）中宿主dna残留量进行适用性验证及应用。方法利用微磁珠与蛋白溶液中dna的特异性结合，来提取样品中残留的宿主细胞dna。将已知浓度的细胞dna对照系列稀释后，作为标准品dna与提取的dna同时进行qPCR扩增。根据标准品dna的循环阈值与浓度之间的线性关系，对未知样品中残留dna进行定量分析。结果标准品检测范围在0．03～3000．00Pg／反应。该方法的标准曲线决定系数≥O．980，扩增效率为90．O％～110．00。质控样品回收率为50％～150％，相对标准偏差均小于30％。实验结果的各项参数均在要求范围内。结论磁珠法可解决残留dna检测中样品前处理的技术难点，qPCR能够简便、快速、准确地对EVTl疫苗生产过程中的dna残留量进行定量测定。该法适用于EV71疫苗中dna残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制，对其他采用同样细胞基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。

关键词：定量聚合酶链反应 Veto细胞 dna残留磁珠法宿主细胞

人用狂犬病疫苗(Vero细胞)dna残留控制的相关探讨

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中国生物制品学杂志 2019年第10期32卷 1164-1168页

作者：赵欣李敏罗建辉国家药品监督管理局药品审评中心

人用狂犬病疫苗生产经历了神经组织、禽胚及细胞培养3个发展阶段[1-2]。随着生物技术发展,不同时期生产企业采用不同细胞、工艺进行生产,制品的质量不断提升。目前,国内已上市人用狂犬病疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系(primary c... 详细信息

人用狂犬病疫苗生产经历了神经组织、禽胚及细胞培养3个发展阶段[1-2]。随着生物技术发展,不同时期生产企业采用不同细胞、工艺进行生产,制品的质量不断提升。目前,国内已上市人用狂犬病疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系(primary cell lines,PCLs)、传代细胞系(continuous cell lines,CCLs)及二倍体细胞系(diploid cell lines,DCLs),代表性的细胞基质分别为原代地鼠肾细胞、Vero细胞和MRC-5细胞,其中以采用Vero细胞生物反应器发酵生产为主。

关键词：人用狂犬病疫苗 Vero细胞 dna残留 dna检测质量标准

原核与真核生物宿主dna残留检测方法的建立与比较

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今日药学 2017年第6期27卷 372-374页

作者：周飞燕孔雯雯符美娟广州白云山拜迪生物医药有限公司广东广州511495

目的建立原核生物[大肠杆菌(***)]和真核生物(酵母菌和CHO细胞)宿主dna残留的检测方法,并比较检测方法的灵敏度。方法以***、酵母菌和CHO细胞宿主dna为模板,制备地高辛标记的探针。将探针与宿主dna进行杂交后采用底物显色法显色,建立3... 详细信息

目的建立原核生物[大肠杆菌(***)]和真核生物(酵母菌和CHO细胞)宿主dna残留的检测方法,并比较检测方法的灵敏度。方法以***、酵母菌和CHO细胞宿主dna为模板,制备地高辛标记的探针。将探针与宿主dna进行杂交后采用底物显色法显色,建立3种生物宿主dna残留检测方法,并比较温度对检测方法灵敏度的影响。结果建立了***、酵母菌和CHO细胞宿主dna的检测方法,灵敏度高达10 pg;同一条件下真核生物宿主dna残留检测方法的灵敏度要高于原核生物。结论该检测方法具有灵敏度高、准确性好、操作简便等优势,可用于***、酵母菌和CHO细胞宿主dna残留的检测及质量控制。

关键词：原核生物真核生物 dna残留杂交

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子宿主dna残留的研究

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今日药学 2013年第4期23卷 223-226页

作者：林秀菁孔雯雯广州白云山拜迪生物医药有限公司广东广州511495

目的建立及优化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)宿主dna残留的检测方法。方法基于固相斑点杂交原理,以rhGM-CSF的工程菌dna为模板,制备地高辛标记的探针,用试剂盒及药典的方法处理阳性对照品,并将其与探针进行杂交,采用底... 详细信息

目的建立及优化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)宿主dna残留的检测方法。方法基于固相斑点杂交原理,以rhGM-CSF的工程菌dna为模板,制备地高辛标记的探针,用试剂盒及药典的方法处理阳性对照品,并将其与探针进行杂交,采用底物显色法和化学发光法显色,建立灵敏度较高的检测方法;运用建立的方法检测2批次rhGM-CSF原液中dna残留量。结果样品经试剂盒处理,杂交后采用化学发光法显色灵敏度较高,可达到10 pg;2批rhGM-CSF原液每人份剂量的宿主dna残留量均小于100 pg。结论该方法具有检测灵敏度高、准确性好、操作简便等优势,可用于rhGM-CSF原液的检测及质量控制。

关键词：重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 dna残留地高辛杂交