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基于dna分子识别探针及信号扩增策略的博来霉素检测新方法研究

基于DNA分子识别探针及信号扩增策略的博来霉素检测新方法研究

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作者：王慧娟山东大学

学位级别：硕士

博来霉素,是一种重要的抗癌药物,疗效显著且具有低骨髓抑制和低免疫抑制的优势,被广泛应用于多种癌症的治疗,如鳞状细胞癌、生殖细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、子宫颈癌以及恶性淋巴瘤等。博来霉素的治疗窗较窄,且由于个体差异,相同剂量的药... 详细信息

博来霉素,是一种重要的抗癌药物,疗效显著且具有低骨髓抑制和低免疫抑制的优势,被广泛应用于多种癌症的治疗,如鳞状细胞癌、生殖细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、子宫颈癌以及恶性淋巴瘤等。博来霉素的治疗窗较窄,且由于个体差异,相同剂量的药物在不同的患者体内会表现出不同的血药浓度。因此,博来霉素血药浓度监测对于制定合理有效的临床给药方案、提高其抗癌疗效以及降低毒副作用具有重要意义。博来霉素具有选择性裂解dna链的性质,因此利用特定dna链作为反应底物识别博来霉素,可以建立基于dna纳米技术的生物传感方法,用于博来霉素的灵敏、特异检测。相比于其他检测技术,基于dna纳米技术的生物传感方法具有灵敏、特异、操作简单及可程序化设计的优势。本论文以dna纳米技术为基础,设计并构建了新型的博来霉素dna识别探针,结合酶介导的信号放大策略,建立了新型的生物传感分析方法,并将其用于博来霉素灵敏、特异、免标及快速检测。本论文第一章为绪论部分,对博来霉素的发现和临床应用、博来霉素裂解dna链的机理及博来霉素检测方法进行了概述。并对生物传感技术中常用的dna分子识别探针和酶介导的等温信号扩增策略进行了介绍。本论文第二章,设计并构建了一种新型的博来霉素识别探针——双环发夹探针,并利用该探针建立一种荧光生物传感器,实现了博来霉素的免标记、灵敏检测。双环发夹探针包含两个功能区域：博来霉素识别位点5’-GTGC-3’和dna触发序列。首先,博来霉素能够特异性识别该探针,并将其切割,释放触发序列。过量的探针则能够通过dna分子内杂交将dna触发序列沉默,从而降低方法的背景。接着,触发序列触发循环的链取代扩增反应（SDA）,实现检测信号的放大,检测限达0.34 nM,线性范围为2 nM-220 nM,且首次实现了博来霉素的免标记检测。该方法能够准确区分博来霉素及其它抗肿瘤药物,具有良好的选择性。此外,方法的人血清回收率均在为95%-99%之间,说明该方法的准确性良好。但临床实验表明,在静脉注射给药方式下,人体内博来霉素血药浓度变化范围（24 h）为1.4nM-2.7μM,因此本方法的灵敏度仍不能满足临床血药浓度监测的需要。为了进一步提高博来霉素检测方法的灵敏度,本论文第三章利用双环发夹探针介导的级联信号扩增策略,建立了多重放大荧光传感体系,实现了博来霉素的高灵敏、免标记检测。该方法中,博来霉素识别并切割双环发夹探针,释放dna触发序列。接着触发序列介导链取代扩增反应（SDA）和指数扩增反应（EXPAR）,实现信号的级联放大。本方法的检测达35 pM,线性范围为40 pM-10 nM,能够满足临床24 h内患者血药浓度监测对方法灵敏度的要求。该方法能够准确区分博来霉素及其它抗肿瘤药物,具有良好的选择性。同时方法在人血清中的回收率为95%-97%,说明本方法具有良好的准确性,能够用于实际样品中博来霉素的定量检测。

关键词：博来霉素 dna分子识别探针信号扩增荧光传感器

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