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pRev X-GFP dn突变体抑制HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎病毒复制的实验研究

中华肝脏病杂志 2004年第7期12卷 392-394页

作者：宋家武林菊生孔心涓梁扩寰华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所武汉430030

目的建立pRev X-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆,进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶,运用dn突变体技术,进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用。方法运用基因工程技术,分别以逆转录... 详细信息

目的建立pRev X-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆,进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶,运用dn突变体技术,进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用。方法运用基因工程技术,分别以逆转录病毒载体pRev TRE为载体,构建表达野生型HBV X蛋白,GFP蛋白和X与GFP融合的X-GFP融合蛋白的质粒,并分别导入乙型肝炎的转基因细胞株HepG22.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中,并通过长期的潮霉素抗性选择,获得能稳定表达dn蛋白的2.2.15细胞克隆。应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV dnA,Southern blot检测细胞内HBV复制中间体,以观察其表达对HBV病毒复制的影响。结果所构建的pRev X-GFP突变体、pRev Xwt、pRev GFP质粒均能在2.2.15细胞株中稳定高效表达。pRev X-GFP高效表达后,能有效地抑制或阻断细胞内HBV核酸合成及其分泌入细胞上清液。定量聚合酶链反应结果显示,pRev X-GFP组的平均每毫升HBV dnA浓度较2.2.15细胞组分别下降1.0～1.8lg值,对细胞内外dot blot结果进行图像分析,其灰度值仅为对照2.2.15细胞组的7.9％,Southern blot分析则发现,X基因dn突变体对HBV复制中间体rcdnA、ssdnA及dsdnA的形成有全面抑制作用。结论 pRev X-GFP dn突变体具有显著抑制HBV复制作用。

关键词： pRev X-GFP dn突变体 HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎病毒复制实验

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HBX-GFP基因工程dn突变体瞬时表达及乙型肝炎病毒复制的实验研究

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中华肝脏病杂志 2003年第1期11卷 47-49页

作者：林菊生梁扩寰宋家武华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所武汉430030

寻找有效的乙型肝炎病毒(HBV)的基因治疗方法,成为当前抗HBV感染的研究热点.新近出现的dn突变体技术(Dominant negative mutant)[1,2],显示出了良好的抗HBV作用苗头.

关键词： HBX-GFP 基因工程 dn突变体瞬时表达乙型肝炎病毒复制实验研究

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HBx—GFP基因工程dn突变体瞬时表达抑制乙型肝炎病毒的实验研究

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胃肠病学 2002年第B11期7卷 45-45页

作者：宋家武林菊生等华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所430030

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乙型肝炎病毒核心蛋白突变体抑制病毒颗粒包装的实验研究

乙型肝炎病毒核心蛋白突变体抑制病毒颗粒包装的实验研究

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作者：武文斌第二军医大学

学位级别：硕士

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)持续性感染在我国是一个严重的健康问题，探索有显著疗效的治疗措施是目前的研究热点。基因治疗是抗HBV持续性感染一个颇有希望的途径。随着分子生物学的发展，对HBV生物学性状尤其是复制、包... 详细信息

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)持续性感染在我国是一个严重的健康问题，探索有显著疗效的治疗措施是目前的研究热点。基因治疗是抗HBV持续性感染一个颇有希望的途径。随着分子生物学的发展，对HBV生物学性状尤其是复制、包装过程的了解逐步加深：HBV颗粒包装始于核心颗粒(core particle)的形成，二个核心蛋白形成一个二聚体，120个二聚体聚合成一个核心颗粒。核心颗粒与前基因组RNA、dnA聚合酶结合，被覆表面蛋白后，包装形成成熟的HBV颗粒。在这一过程中，起关键作用的是C蛋白二聚体的形成。利用突变型HBV C蛋白干扰野生型C蛋白形成二聚体的显性负调节(dominant negative，dn)突变体，已证明在体外有明显抑制HBV颗粒包装的作用，有望成为in vivo基因治疗HBV 持续感染的理想方法。基于对HBV分子生物学性状和抗HBV感染胞内免疫的相关研究成果，本研究对中国人adr亚型HBV体外dn突变体治疗进行了基础研究。为此，我们通过PCR从 pHBV-A质粒中扩增了全长的C基因及S基因，亚克隆至pGEM-T载体上后，选择合适方向的两株质粒进行C基因与S基因融合。构建出C蛋白C末端与S蛋白N末端的融合基因表达质粒pcdnA3.1-CS。该表达载体经脂质体介导同时转染两株细胞 HepG2及HepG2215。转染48-72h后加入G418筛选10天左右。挑选阳性克隆扩增后，RT-PCR和免疫组化证实了突变核心蛋白的胞内表达。直接抽提HepG2215细胞浆内HBV dnA，斑点杂交显示表达了突变C蛋白(融合蛋白)的HepG2215细胞浆内HBV dnA量不同程度地低于阴性对照组(未转染质粒和转染pcdnA3.1空质粒)。 10％ HBV阳性血清(PCR证实HBV dnA的存在)感染HepG2后72h，抽提细胞浆内 HBV dnA。斑点杂交显示，与阴性对照组比较，表达了突变C蛋白的HepG2不同程度地抑制了HBV的攻击。以上工作表明，本研究所构建的pcdnA3.1-CS真核表达载体可以在HepG2及 HePG2215细胞内表达出突变型核心蛋白，进一步研究表明该突变蛋白具有抗HBV 颗粒包装的显性负调节功能，能不同程度地提高转染细胞的胞内免疫能力。本研究在成功构建了中国人adr亚型HBV感染的突变型核心蛋白表达载体的同时，证实了国外dn突变体抗病毒感染结论，为进一步dn突变体抗HBV感染研究奠定了基础。

关键词： HBV 融合基因 dn突变体真核表达载体基因治疗

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慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究现状

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实用肝脏病杂志 2000年第4期5卷 248-250页

作者：高红云张占卿同济大学医学院附属铁路医院上海市200072

我国为乙型肝炎高发区,总流行率达57.6％,其中2.5％发展为慢性肝炎。肝炎后肝硬变和原发性肝痛使慢性乙型肝炎的总死亡率比普通人群高4倍。慢性乙型肝炎经历免疫耐受、免疫清除和免疫抵抗三个阶段,在免疫清除和免疫抵抗阶段,病毒复制增... 详细信息

我国为乙型肝炎高发区,总流行率达57.6％,其中2.5％发展为慢性肝炎。肝炎后肝硬变和原发性肝痛使慢性乙型肝炎的总死亡率比普通人群高4倍。慢性乙型肝炎经历免疫耐受、免疫清除和免疫抵抗三个阶段,在免疫清除和免疫抵抗阶段,病毒复制增加是诱导肝炎反复活动的直接原因。乙型肝炎的慢性化机理尚未完全阐明,寻求终止病毒复制的方法和策略,以控制肝炎活动、防止肝硬变和肝癌,是目前慢性乙型肝炎临床和基础研究的热点。

关键词：治疗慢性乙型肝炎拉米夫定抗病毒治疗研究现状泛昔洛韦 HBeAg 病毒复制类似物 dn突变体肝炎病毒

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