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作者：叶王斌东北林业大学

学位级别：硕士

鸢尾属(Iris)植物为鸢尾科多年生草本植物,是园林应用上重要的观赏植物。鸢尾属植物种类丰富,形态各异,花色以高雅的蓝紫色为主,呈色物质主要为花青素。不同种的蓝色花鸢尾之间可能存在一定的成分、含量差异,从而形成不同蓝色系花,但目... 详细信息

鸢尾属(Iris)植物为鸢尾科多年生草本植物,是园林应用上重要的观赏植物。鸢尾属植物种类丰富,形态各异,花色以高雅的蓝紫色为主,呈色物质主要为花青素。不同种的蓝色花鸢尾之间可能存在一定的成分、含量差异,从而形成不同蓝色系花,但目前这种花色差异形成的物质基础及调控机理还不清楚,蓝色花差异呈色机理的解析对蓝色系花色育种具有重要意义。dfr是花青素生物合成通路下游的重要酶,常通过对催化底物的特异性选择或通过调控下游基因的表达来影响花青素合成进而影响花色呈色。本研究以溪荪(Iris sanguinea)、北陵鸢尾(***)、燕子花(***)、马蔺(*** ***)4种鸢尾为研究对象,通过花青素代谢组学解析不同鸢尾呈色的物质基础,并对花色调控的关键基因dfr进行克隆和功能验证。从代谢产物与分子层面初步探讨了鸢尾蓝色花的呈色机理,为蓝色花分子育种奠定基础。主要的研究结果如下:(1)利用英国皇家园艺比色卡和小型色差计CR-10 Plus对4种鸢尾的花被片颜色进行了测量比较,均属于purple-violet色系。构建的CIELab空间坐标系,发现花色间的明度(L*)、红绿属性(a*)、黄蓝属性(b*)参数相差较大,其中,马蔺L*值较大,花被片色彩偏明亮;北陵鸢尾与燕子花a*值均较大,花被片色彩均偏红色,且北陵鸢尾相较于燕子花L*值稍高,呈现出更明亮的颜色;溪荪花被片b*值最低,在4种鸢尾花被片中呈现最深的蓝色。(2)利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对4种鸢尾盛开期花被片花青素苷定量检测,共检测到61种代谢物质,包括矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药花色素、矮牵牛素、锦葵色素以及黄酮类等物质。溪荪、北陵鸢尾、燕子花、马蔺中的花青素总量分别为137.24、326.65、276.18、137.55μg/g。4种鸢尾花青素成分及含量存在很大差异,北陵鸢尾含有矢车菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷等7种特有代谢物,马蔺含有飞燕草素3-O-半乳糖苷等4种特有代谢物,燕子花中的特有代谢物为矮牵牛素-3-O-桑布双糖苷,而溪荪不存在特有代谢物。北陵鸢尾较高的花青素含量可能提高了其对盐碱、干旱生境的适应性。马蔺花被片中特有物质芦丁及较高黄酮化合物,可能使其具有最强的环境适应性。构建多元线性回归方程分析花色苷与L*、a*、b*色差值之间的关系,确定飞燕草素是4种鸢尾花瓣呈现蓝色的主要色素,矮牵牛素在北陵鸢尾、燕子花中的积累使其花瓣由蓝偏向紫红色,黄酮类物质的积累使马蔺呈现更加明亮的颜色。(3)以4种鸢尾花被片总RNA反转录得到的cDNA为模板,克隆了dfr基因,分别命名为Isdfr(GenBank登录号MH091707)、Itdfr(GenBank登录号OP484852)、Ildfr(GenBank登录号OP484853)、Iladfr(GenBank登录号KY907171.1),基因长度分别为1071bp、1074bp、1068bp和1074bp,分别编码356、357、355、和357个氨基酸。生物信息学分析发现4种dfr均属于结构稳定的亲水性蛋白,不存在跨膜区域和信号肽,具有典型Epimerase结构域。其中,Isdfr蛋白和Itdfr蛋白具有7个糖基化位点,Ildfr蛋白和Iladfr蛋白具有8个糖基化位点。选取16个相似度高的物种的dfr蛋白序列构建系统进化树,发现4种鸢尾与鸢尾科植物荷兰鸢尾亲缘关系最近。根据拟南芥同源蛋白互作网络推测4种dfr蛋白参与植物花青素、黄酮醇、儿茶素和原花青素等物质的合成。(4)用BamH I和Sal I两种限制性内切酶对pCAMBIA1300-GFP空载质粒进行载体线性化,通过同源重组的方法成功构建pCAMBIA1300-Isdfr-GFP、pCAMBIA1300-Itdfr-GFP、pCAMBIA1300-Ildfr-GFP、pCAMBIA1300-Iladfr-GFP载体,并使用冻转法转入农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导的方式将其转入模式植物烟草中,经抗生素筛选和抗性植株的PCR验证,从DNA分子水平上证明了Isdfr、Itdfr、Ildfr、Iladfr基因成功整合到烟草基因组中,各获得3个转基因阳性株系。保留下来的为转Ildfr、Iladfr株系。(5)通过花色表型观察,发现转Ildfr基因烟草(OE-Ildfr)的花色比烟草(WT)深,而转Iladfr基因烟草(OE-Iladfr)的花色较浅。通过盐酸-甲醇法对花瓣花色苷含量检测,发现OE-Ildfr的花色苷含量为65.54μmol/g,比WT(31.48μmol/g)提高了108.20%;而OE-Iladfr花色苷含量为28.90μmol/g,比WT下降8.19%。使用实时荧光定量法检测转基

关键词：鸢尾属代谢组学 dfr基因花色调控花青素

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杭菊dfr基因克隆及其在花中表达特征分析

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中草药 2016年第7期47卷 1187-1192页

作者：陈璐汪涛郭巧生张晓明宋玲珊南京农业大学中药材研究所江苏南京210095

目的克隆杭菊Chrysanthemum morifolium二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,dfr)基因,并研究其在花芽分化期及开花期不同时期的表达特征。方法根据已报道的菊花Chrysanthemum morifolium dfr基因序列设计引物,通过荧光定量PC... 详细信息

目的克隆杭菊Chrysanthemum morifolium二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,dfr)基因,并研究其在花芽分化期及开花期不同时期的表达特征。方法根据已报道的菊花Chrysanthemum morifolium dfr基因序列设计引物,通过荧光定量PCR(RT-PCR)技术从杭菊头状花序中扩增出目的基因片段,连接、转化、挑取阳性克隆测序并拼接;采用基于内参基因的相对定量PCR方法,分析该基因表达量特征。结果得到全长1 152 bp的杭菊dfr基因,最大开放阅读框1 029 bp,共编码342个氨基酸。NCBI上进行Blast比对,该基因与其他植物的dfr基因有很高的同源性。RT-PCR表明该基因在花芽分化时期不同阶段以及开花期不同时期花不同部位中表达量均有差异。花芽分化时期杭菊dfr基因在50 d表达量最高;开花期该基因在时期I的管状花中表达量最高,在时期II的花序托中表达量最低。结论克隆得到杭菊dfr基因c DNA序列,该基因表达存在时间和空间上的差异,表达量在花蕾膨大成熟到舌状花开放30%的时间段内最高。该结果为进一步进行该基因在杭菊中的表达与催化产物的关系和调控机制研究奠定了基础。

关键词：杭菊 dfr基因实时定量PCR 荧光定量PCR 基因克隆

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VIGS技术鉴定药用菊花皇菊中的dfr基因功能研究

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基因组学与应用生物学 2020年第5期39卷 2141-2147页

作者：王自布邓可曹剑锋贵州师范学院贵阳550018 贵州师范学院药用植物生物技术研究所贵阳550018

从药用菊花皇菊中克隆二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,dfr)基因片段,插入病毒诱导载体中来抑制菊花内源性基因的表达,用于其基因功能分析。根据已报道的菊花dfr基因序列(GenBank登录号GU324979)设计引物,克隆部分基因序... 详细信息

从药用菊花皇菊中克隆二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,dfr)基因片段,插入病毒诱导载体中来抑制菊花内源性基因的表达,用于其基因功能分析。根据已报道的菊花dfr基因序列(GenBank登录号GU324979)设计引物,克隆部分基因序列,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析。采用病毒诱导基因沉默技术(VIGS),以菊花的扦插苗生长到第3~4片叶期的菊花植株为实验材料,沉默菊花的dfr基因,用半定量和荧光定量PCR检测病毒诱导沉默后dfr基因的表达。克隆得到黄菊dfr基因的最大开放阅读框为1029 bp,共编码342个氨基酸,等电点是6.03,分子量是41089.36,与同一科属植物之间同源性达到80%以上,说明dfr蛋白氨基酸序列在同一科属间具有高度保守性。根据dfr基因全长设计构建病毒诱导载体的引物得到453 bp的目的基因,命名为Nbdfr。构建病毒载体(TRV)并利用携带目的基因的TRV重组载体病毒感染菊花幼苗,10 d后可以看出菊花出现发育迟缓且叶片皱缩干枯的现象,检测dfr基因发现基因表达下调约20%,但未达到显著性。dfr基因是否被成功沉默还进一步验证。病毒诱导的基因沉默技术可在药用菊花中初步快速鉴定相关基因的功能。

关键词：病毒诱导基因沉默(VIGS) 菊花皇菊 dfr基因

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甜樱桃dfr基因内含子2和内含子3的多态性

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中国农业科学 2012年第2期45卷 320-329页

作者：王廿鄢锦辉张开春王晶张晓明闫国华北京市农林科学院林业果树研究所北京市大兴区兴海学校

【目的】研究70个甜樱桃品种dfr基因多态性与果皮颜色的相关性。【方法】通过DNA序列分析,以不同果皮颜色的10个甜樱桃品种(Prunus avium L.)为材料,检测dfr基因的多态性。根据多态性出现的位点设计特异引物,通过PCR扩增检测70个甜樱桃... 详细信息

【目的】研究70个甜樱桃品种dfr基因多态性与果皮颜色的相关性。【方法】通过DNA序列分析,以不同果皮颜色的10个甜樱桃品种(Prunus avium L.)为材料,检测dfr基因的多态性。根据多态性出现的位点设计特异引物,通过PCR扩增检测70个甜樱桃品种dfr基因的多态性。【结果】获得甜樱桃dfr基因约1 kb的片段,测序结果用BLAST分析发现,其核苷酸序列与樱桃李(Prunus cerasifera)的核苷酸相似性为80%,预测的氨基酸序列与已知的甜樱桃(***)dfr氨基酸序列相似性达99%。该片段由3个外显子和3个内含子组成,2个多态性位点分别在内含子2和内含子3上。在黄色、黄底红晕和红色果皮3个组的70个甜樱桃品种中发现3个单倍型,共5种单倍型组合。通过SAS 9.0软件分析发现,所检测到的dfr基因的等位基因频率在黄底红晕果皮品种组和红色品种果皮组中的分布无显著差异。【结论】本研究在甜樱桃dfr基因座上得到2个差异位点,分别在内含子2和内含子3内,其优势基因频率依次为:0.864和0.679;但未发现dfr基因内含子2和内含子3的多态性与果皮颜色之间存在直接关系。

关键词：甜樱桃 dfr基因果皮颜色等位基因频率基因多态性

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石斛兰dfr基因的克隆、序列分析及原核表达

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园艺学报 2010年第1期37卷 129-134页

作者：潘丽晶张妙彬范干群陈伟庭曹友培珠海市农业科学研究中心广东珠海519070

二氢黄酮醇4-还原酶(dfr)在不同花色形成中起着关键作用。利用RT-PCR方法从石斛兰中克隆出dfr基因,并命名为Dendfr。该序列全长1164bp,编码352个氨基酸。氨基酸序列分析发现,Dendfr与3种兰科植物的dfr氨基酸序列同源性达81%～86%,与其... 详细信息

二氢黄酮醇4-还原酶(dfr)在不同花色形成中起着关键作用。利用RT-PCR方法从石斛兰中克隆出dfr基因,并命名为Dendfr。该序列全长1164bp,编码352个氨基酸。氨基酸序列分析发现,Dendfr与3种兰科植物的dfr氨基酸序列同源性达81%～86%,与其他非兰科植物的dfr氨基酸同源性在56%～72%之间。在DendfrN-末端存在一个保守的NADP结合区,序列中存在26个氨基酸组成的底物特异结合区,其中134位氨基酸处存在特异的天冬酰胺N位点。将Dendfr的编码区克隆到pQE30载体中,在大肠杆菌中高效表达了该蛋白,为进一步研究石斛兰花色形成机制及花色改良基因工程打下基础。

关键词：石斛兰花色 dfr基因克隆序列分析原核表达

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刺葡萄dfr基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

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热带作物学报 2018年第6期39卷 1128-1136页

作者：甘煌灿赖呈纯潘红朱育菁福建省农业科学院农业工程技术研究所福建福州350003 福建省农业科学院农业生物资源研究所福建福州350003

本研究以从刺葡萄克隆获得的dfr基因为目的基因,同时从质粒p CAMBIA1302中扩增获得Ca MV35S启动子和NOS终止子,并利用双酶切法构建由Ca MV35S启动子驱动dfr基因且带有NOS终止子的表达载体,验证测序结果显示成功构建了p CAMBIA1302-35S-D... 详细信息

本研究以从刺葡萄克隆获得的dfr基因为目的基因,同时从质粒p CAMBIA1302中扩增获得Ca MV35S启动子和NOS终止子,并利用双酶切法构建由Ca MV35S启动子驱动dfr基因且带有NOS终止子的表达载体,验证测序结果显示成功构建了p CAMBIA1302-35S-dfr-NOS植物表达载体,并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达,经鉴定,转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织,经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织,经PCR鉴定,茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和dfr基因等的存在,初步证明目的基因dfr已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立,验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性,为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。

关键词：茉莉花 dfr基因植物表达载体愈伤组织遗传转化

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刺葡萄dfr基因克隆及生物信息学分析

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福建农业学报 2016年第7期31卷 683-689页

作者：赖呈纯黄贤贵甘煌灿潘红范丽华福建省农业科学院农业工程技术研究所福建福州350003

根据葡萄dfr基因CDS序列设计刺葡萄开放阅读框(ORF)特异引物,利用RT-PCR技术克隆获得其dfr基因序列,并通过生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,刺葡萄dfr基因ORF序列全长1 014bp,编码337个氨基酸,命名为Vitis davidii dihydrofla... 详细信息

根据葡萄dfr基因CDS序列设计刺葡萄开放阅读框(ORF)特异引物,利用RT-PCR技术克隆获得其dfr基因序列,并通过生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,刺葡萄dfr基因ORF序列全长1 014bp,编码337个氨基酸,命名为Vitis davidii dihydroflavonol 4-reductase gene(Vddfr),GenBank登录号为KF915803。刺葡萄dfr蛋白预测分子量为37 593.2Da,理论等电点pI为5.81,是一个跨膜亲水蛋白,无典型信号肽,不属于分泌蛋白,并且亚细胞定位主要位于细胞质中(70%);二级结构以无规则卷曲为主(52.82%),是一种mixed类蛋白;该蛋白有潜在的7个糖基化位点和16个磷酸化位点,具有NAD(P)结合位点,有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域,属于NADB_Rossmann超家族成员。核苷酸序列分析表明,刺葡萄dfr基因与美丽葡萄、山葡萄和酿酒葡萄的同源性为99%,与圆叶葡萄同源性为98%,与显齿蛇葡萄同源性为94%,进化上比较保守,利用dfr基因编码区碱基序列所建立的系统关系树与真实的植物进化基本一致。

关键词：刺葡萄二氢黄酮醇4-还原酶 dfr基因克隆生物信息学

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一株园林观赏石榴dfr基因的生物信息学分析

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中国南方果树 2016年第5期45卷 95-100页

作者：胡勇成都纺织高等专科学校成都611731

花色素苷是影响植物花色的主要色素,二氢黄酮4-还原酶(dfr)是花色素合成途径的关键酶之一。选择四川成都某公园一株园林观赏石榴,通过克隆获得其dfr基因的cDNA全长序列,进行生物信息学分析。结果显示,该基因含有1个1 026bp的开放阅读框... 详细信息

花色素苷是影响植物花色的主要色素,二氢黄酮4-还原酶(dfr)是花色素合成途径的关键酶之一。选择四川成都某公园一株园林观赏石榴,通过克隆获得其dfr基因的cDNA全长序列,进行生物信息学分析。结果显示,该基因含有1个1 026bp的开放阅读框,编码341个氨基酸,推导的dfr蛋白分子量为38.47kD,等电点为6.15,属于NADB-Rossmann超基因家族,不含信号肽和跨膜区,为亲水性蛋白,亚细胞定位细胞质的可能性最高,主要的二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲。系统发育分析结果显示,本研究中石榴dfr蛋白序列与GenBank中石榴聚为一簇,表现出较高的保守性。

关键词：观赏石榴 dfr基因生物信息学

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枸杞dfr基因cDNA片段的克隆及生物信息学分析

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江苏农业科学 2013年第10期41卷 33-36页

作者：尚洁赵海燕朱武政北方民族大学生物科学与工程学院宁夏银川750021 西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041

二氢黄酮醇4-还原酶(dfr,1.***.1.219)是类黄酮代谢中花青素合成的一种主要调控酶,它依赖NADPH还原二氢黄酮醇为无色花色素。以枸杞为材料,利用序列同源原理和RT-PCR技术得到1条dfr基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因的cDNA... 详细信息

二氢黄酮醇4-还原酶(dfr,1.***.1.219)是类黄酮代谢中花青素合成的一种主要调控酶,它依赖NADPH还原二氢黄酮醇为无色花色素。以枸杞为材料,利用序列同源原理和RT-PCR技术得到1条dfr基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因的cDNA片段长为893 bp,编码297个氨基酸,蛋白分子量为33.94 ku,等电点为6.08。氨基酸序列和结构分析显示dfr基因具有典型的NAD(P)-binding Rossmann-fold结构域。Lydfr蛋白很可能定位在细胞质。二级结构和三级结构进行预测,发现Lydfr蛋白中无规则卷曲114个,α螺旋和β折叠分别为124个和18个,延伸链41个。系统进化分析表明,枸杞Lydfr基因与马铃薯和番茄的dfr基因具有很高的同源性。这个基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为KC795560。

关键词：枸杞 dfr基因克隆生物信息学分析

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石榴dfr基因的同源克隆及分析

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江苏农业科学 2013年第4期41卷 22-24页

作者：陶吉寒招雪晴苑兆和尹燕雷冯立娟山东省果树研究所山东泰安271000

以石榴品种"重瓣粉花"的花瓣为材料,根据GenBank中登录的相关物种dfr基因的保守序列设计兼并引物,采用RT-PCR扩增出446 bp大小的cDNA片段。根据获得的保守片段,设计特异引物,进行3'RACE-PCR,获得了dfr基因的3'端,进行电子拼接后获得了1 ... 详细信息

以石榴品种"重瓣粉花"的花瓣为材料,根据GenBank中登录的相关物种dfr基因的保守序列设计兼并引物,采用RT-PCR扩增出446 bp大小的cDNA片段。根据获得的保守片段,设计特异引物,进行3'RACE-PCR,获得了dfr基因的3'端,进行电子拼接后获得了1 161 bp的cDNA,编码327个氨基酸,编码的蛋白具有典型的dfr蛋白功能结构域。GenBank登录号为KC430327。

关键词：石榴 dfr基因克隆序列

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