检索结果-南通市图书馆

作者：曹影丽安徽农业大学

学位级别：硕士

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是属于腺病毒科(Adenoviridea)腺病毒属(genus Aviadenovirus)的一种基因组大小为43～45kb的无囊膜双链DNA病毒,主要表现的临床特征为肝炎-心包积水综合征(HHS),具有强传播性和高死... 详细信息

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是属于腺病毒科(Adenoviridea)腺病毒属(genus Aviadenovirus)的一种基因组大小为43～45kb的无囊膜双链DNA病毒,主要表现的临床特征为肝炎-心包积水综合征(HHS),具有强传播性和高死亡率,严重威胁家禽业发展。chcGAS(Chicken cyclic GMP-AMP synthase,chcGAS)是一种在鸡中发现的天然免疫调节蛋白,在抗病毒感染,特别是DNA病毒感染中发挥着重要作用,它可以感知DNA病毒的存在从而激活先天免疫反应参与抗病毒感染。FAdV-4作为一种DNA病毒,是否能够被chcGAS识别并发挥抗病毒功能还尚待解析。因此,本研究旨在探索chcGAS通过激活抗病毒天然免疫从而产生免疫应答诱导下游级联免疫反应抵御FAdV-4的感染,同时构建了稳定表达chcGAS的df-1细胞系,为后续深入研究chcGAS参与天然免疫的精细调控作用机制提供了细胞模型。主要研究内容及结果如下:***基因的克隆表达、生物特性分析及FAdV-4感染后亚细胞定位本研究首先利用PCR技术成功克隆了鸡的cGAS基因、分析其生物学特性。利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域等。其次利用构建的原核表达载体p ET-32a-chcGAS、p Cold-TF-chcGAS通过大肠杆菌表达系统表达蛋白,蛋白表达后进行Western blot鉴定。最后利用构建的真核表达载体pm Cherry-C1-chcGAS、p CAGGS-HA-chcGAS在LMH细胞中FAdV-4感染前后进行细胞定位。结果显示,chcGAS基因全长1317bp,编码438个氨基酸;生物信息学分析表明该蛋白为稳定亲水性蛋白,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在40个磷酸化位点,二级结构预测该蛋白包含α螺旋、β转角、无规卷曲及延伸链4种类型。分析发现cGAS在物种间同源性虽然不高,但由于其结构域中含有Mab-21使鸡cGAS在进化上比较保守并且鸡cGAS与鸭亲缘关系较近,与鱼类亲缘关系最远;组织分布表达量显示chcGAS在各个组织中均有表达,且在回肠、盲肠、胸腺中具有高表达量,在脑、气管、肾中表达量较低;成功表达出chcGAS蛋白且主要以上清液的形式表达;观察其定位在FAdV-4感染前后的变化情况,当未感染时chcGAS主要定位于细胞核膜上,但当感染后chcGAS定位从细胞核膜转移至细胞质中。***在FAdV-4感染复制中的作用研究为探究chcGAS对FAdV-4复制的影响,本研究将真核表达载体p CMV-3×FlagchcGAS转染至LMH细胞中再用FAdV-4感染,收取感染后的细胞样品,利用RTq PCR测定IFN-β、炎症因子及一些抗病毒蛋白基因的表达水平,结果表明,chcGAS可以增强IFN-β启动子活性,并促进IL-6、IL-8、IFN-α、IRF7、TBK1、NF-κB、Mx-1、IFITM1、IFITM3的表达量,此外,将chcGAS过表达至LMH细胞中,转染24h用FAdV-4感染细胞,通过RT-q PCR、Westren blot及IFA技术分别检测FAdV-4病毒的拷贝数、蛋白表达水平及FAdV-4的复制,分析结果发现chcGAS的表达在不同水平都表现出对FAdV-4具有一定的抑制作用。3.稳定表达chcGAS的df-1细胞系的筛选与鉴定为了后续深入研究chcGAS参与天然免疫的相关作用,通过慢病毒包装系统构建稳定表达chcGAS的df-1细胞系,首先利用同源重组技术构建chcGAS基因重组慢病毒表达载体,然后将该慢病毒表达质粒与另外两个辅助质粒(p MD2.G、ps PAX2)共转染到293T细胞中进行慢病毒包装获得慢病毒液,感染df-1细胞,感染48h后用嘌呤霉素持续加压筛选待所有细胞均出现绿色荧光则表明细胞系筛选完成,并对筛选的细胞系进行Westren blot鉴定,结果表明,成功构建了稳定表达chcGAS的细胞系。综上所述,本研究成功克隆表达出鸡cGAS基因并对该蛋白的基本特性进行了分析,分析其定位发现当DNA病毒FAdV-4感染过表达chcGAS后可从细胞核膜转移到细胞质中;探明chcGAS在FAdV-4感染诱导IFN-β、炎症因子、抗病毒蛋白的产生及病毒复制中的作用,明确了chcGAS可以调控抗病毒天然免疫反应从而对FAdV-4的复制具有一定的抑制作用,为研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供了重要科学依据;最后本研究构建了稳定表达chcGAS的df-1细胞系,为深入研究chcGAS在禽类中的免疫调控机制以及其在疫苗研发中的应用提供了有价值的信息。

关键词：血清4型禽腺病毒鸡cGAS Ⅰ型干扰素 df-1细胞系抗病毒天然免疫

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PI3K/Akt抑制剂对鸡朊蛋白过表达df-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

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畜牧兽医学报 2015年第10期46卷 1844-1850页

作者：万学瑞朱曼玲杨润霞刘桂林刘磊吴润甘肃农业大学动物医学院兰州730070

为探讨PI3K/Akt信号通路在鸡细胞型朊蛋白(ChPrPC)过表达的df-1细胞(df-1-PrP)增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrPC表达量的关系,以df-1-PrP细胞为模型,空载体转染的df-1-NC细胞和df-1细胞为对照,分别用0、10、20、50、100... 详细信息

为探讨PI3K/Akt信号通路在鸡细胞型朊蛋白(ChPrPC)过表达的df-1细胞(df-1-PrP)增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrPC表达量的关系,以df-1-PrP细胞为模型,空载体转染的df-1-NC细胞和df-1细胞为对照,分别用0、10、20、50、100、200nmol·L-1渥曼青霉素处理以抑制PI3K/Akt信号通路,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因转录量。结果显示,随着渥曼青霉素浓度的增加,df-1-PrP、df-1-NC和df-1细胞的PRNP基因转录量均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在低于100nmol·L-1的同一渥曼青霉素浓度下,df-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于对照组,而总凋亡率均低于对照组。本研究表明ChPrPC的过量表达可促进df-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,在以上过程中,PI3K/Akt信号通路可能具有重要的作用,渥曼青霉素能有效阻断这一通路,但PI3K/Akt信号通路并不是ChPrPC调节细胞凋亡的唯一途径。

关键词： PI3K/Akt 鸡朊蛋白 df-1细胞系渥曼青霉素凋亡

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蛋白激酶CK2抑制剂对鸡朊蛋白高表达和抑制表达df-1细胞生物学行为的影响

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畜牧兽医学报 2016年第5期47卷 985-992页

作者：万学瑞杨润霞王川刘桂林吴润甘肃农业大学动物医学院兰州730070

为探讨CK2在鸡细胞型朊蛋白(ChPrP^C)高表达和抑制表达的df-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrP^C表达量的关系,以df-1-PrP和df-1-SiRNA-3细胞为模型,df-1细胞为对照,分别用0、25、50、100nmol·L^(-1)米托蒽醌处理以... 详细信息

为探讨CK2在鸡细胞型朊蛋白(ChPrP^C)高表达和抑制表达的df-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrP^C表达量的关系,以df-1-PrP和df-1-SiRNA-3细胞为模型,df-1细胞为对照,分别用0、25、50、100nmol·L^(-1)米托蒽醌处理以抑制CK2,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因mRNA转录。结果显示,df-1-PrP、df-1-SiRNA-3和df-1细胞的PRNP基因mRNA转录量随着米托蒽醌浓度的增加均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在同一米托蒽醌浓度下,df-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于df-1细胞,总凋亡率均低于df-1细胞;df-1-SiRNA-3细胞则相反。表明ChPrP^C的高表达可促进df-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,而ChPrP^C的低表达则相反;CK2在ChPrP^C介导df-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中具有重要的作用。本研究结果为进一步阐明ChPrP^C生理功能的分子机制奠定基础。

关键词：蛋白激酶2 鸡朊蛋白 df-1细胞系米托蒽醌凋亡

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马立克氏疫苗病毒在鸡传代细胞上的培养工艺

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中国兽医学报 2014年第8期34卷 1244-1247,1252页

作者：刘玉鹏赖汉漳李延鹏罗琼陈瑞爱农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室肇庆大华农生物药品有限公司广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院广东广州510642

为探索马立克氏病(Marek's disease,MD)疫苗病毒在df-1细胞系上的最佳培养工艺以及由此方法制备的马立克氏病疫苗对鸡的保护效力,通过进行培养基和血清选择、病毒在df-1细胞上接种稀释度和接种方式选择以及滴度测定,并制备以df-1细胞为... 详细信息

为探索马立克氏病(Marek's disease,MD)疫苗病毒在df-1细胞系上的最佳培养工艺以及由此方法制备的马立克氏病疫苗对鸡的保护效力,通过进行培养基和血清选择、病毒在df-1细胞上接种稀释度和接种方式选择以及滴度测定,并制备以df-1细胞为基质的CVI988和FC-126病毒疫苗,按中华人民共和国兽用生物制品规程(2000)检验合格后与其他商品苗进行保护效率对比试验。结果表明,试验成功探索了CVI988和FC-126病毒在df-1细胞系上的培养工艺,以df-1细胞为基质制备的疫苗也取得了和其他商品苗保护率相当的良好效果,因此推断df-1细胞可以作为马立克氏病疫苗病毒的传代细胞培养候选基质。

关键词：马立克氏病病毒 df-1细胞系培养工艺保护指数

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禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对df-1细胞自噬的影响

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中国畜牧兽医 2023年第5期50卷 1971-1980页

作者：程前高清清王雨禾郇长超高崧扬州大学兽医学院扬州225009 江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心扬州225009

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对df-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收o... 详细信息

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对df-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收ompA基因片段,经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞df-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况;通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对df-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,获得大小分别为1038和4700 bp的条带,大小与载体和目的片段相符,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染df-1细胞后,通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光,Western blotting检测到大小为65 ku的蛋白条带,表明成功转染pEGFP-N1-ompA至df-1细胞中并大量表达ompA-EGFP融合蛋白。同时Western blotting结果显示,过表达OmpA可引起自噬标志性蛋白LC3Ⅱ的表达量增加;通过透射电子显微镜可观察到df-1细胞中的自噬小体。将单荧光GFP-LC3质粒转染df-1细胞,OmpA蛋白处理组呈现绿色荧光点的聚集,说明OmpA引发df-1细胞自噬。进一步研究发现,OmpA影响自噬标志蛋白p62降解,转染双荧光mRFP-GFP-LC3质粒检测显示OmpA可阻断自噬流的发生。【结论】APEC外膜蛋白OmpA可引起df-1细胞发生自噬,但其抑制自噬流的发生,引发df-1细胞的不完全自噬,这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。

关键词：禽致病性大肠杆菌 OmpA df-1细胞系不完全自噬

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CIAV M突变株致病性试验及其在df-1上生长适应性的研究

CIAV M突变株致病性试验及其在DF-1上生长适应性的研究

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作者：孙丹丹河北农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）为鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia, CIA）的病原,属圆环病毒科（Circoviridae）,为单股、负义、共价结合的环状DNA。CIAV基因组只产生一个具有多顺反子特性的转... 详细信息

鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）为鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia, CIA）的病原,属圆环病毒科（Circoviridae）,为单股、负义、共价结合的环状DNA。CIAV基因组只产生一个具有多顺反子特性的转录子。转录子上有三个AUG密码子,使其内部形成三个开放阅读框架（Open reading frames,ORFs）,其中ORF3（366bp）位于OFR2（651bp）内,ORF2与ORF1（1350bp）部分重叠。ORFs分别编码VP3（13kD）、VP2（24kD）和VPl（52kD）三种病毒蛋白。VP1为结构蛋白,是中和抗原位点的组成部分;VP2为VP1的伴侣蛋白或骨架蛋白,与VP1在宿主细胞内共同诱发机体产生中和抗体;VP3是CIAV的主要致病性蛋白,可诱导细胞凋亡。北京市农林科学院高新技术实验室夏永恒等人采用PCR定点突变技术使编码CIAV VP3的起始密码子后移了39位,造成VP3的不完全表达,成功构建了pTCAVm阳性克隆株并初次获得了感染性克隆。本试验将从重组阳性克隆株开始,继续研究CIAV M突变体的致病性和其对df-1细胞系的嗜性,为寻找更好的研制CIA减毒活疫苗的方案奠定基础。本试验选取保存于-80℃的pTCAVm阳性克隆株,按照夏永恒等人将突变株体外环化的试验方法,重新复壮pTCAVm重组菌株,提取重组质粒,酶切鉴定后,使CIAV突变基因自身环化。用脂质体转染方法,将自身环化突变株转染到MDCC-MSB1宿主细胞内,并采用IFA及RT-PCR方法进行转染细胞内病毒复制情况的检测及CIAV序列测定,试验结果证明本试验同样获得了具有感染性的突变株-CIAV M突变株。用人工腹腔注射方法,将CIAV M突变株毒液接种于1日龄SPF鸡,并动态追踪CIAV M突变株在SPF鸡体内的致病性及在SPF鸡体内传代一次后对宿主细胞的致病性。用IFA方法,测得的CIAV M突变株的TCID值为10/mL;通过临床剖检变化及病理切片方法观察到:7、14、21日龄时,CIAV M突变株能够引起SPF鸡增重缓慢,胸腺等免疫器官内T淋巴细胞消失、组织萎缩,鸡腿骨骨髓颜色变为黄粉色,红细胞容积值显著下降等CIA的特征性病变;体内CIAV抗体水平检测结果显示:抗体水平表现为弱阳性,提示CIAV M突变株具有抗原性;采用流式细胞术测定感染的宿主细胞生长周期及细胞凋亡情况,试验结果显示:回归动物试验后的CIAV M突变株对MDCC-MSB1宿主细胞周期无明显阻滞作用,但其具有致宿主细胞凋亡作用。通过与CUX-1标准毒株的同行比较,整个试验结果显示:CIAV M突变株具有感染性,但其致病性明显减弱。CIAV在MDCC-MSB1宿主细胞的病毒滴度较低,不利于CIAV的疫苗生产,因此本试验还试探性的将CIAV M突变株接种于df-1细胞系中,为CIAV M突变株寻找一种新的生长细胞系。将CIAV M突变株接种于df-1细胞系,经过5-7天的培养,六个重复组没有全部出现纤维细胞拉网、变圆等细胞病变;再次传代时,采用盲传方法,接种毒液为上一代细胞反复冻融获得的或直接从细胞板刮取的,经过5-7天的培养,六个重复组仍然没有全部出现细胞病变。CIAV M突变株通过接种于df-1细胞系,传代15次,用PCR方法检测每代收取的细胞液,并利用IFA和RT-PCR方法验证PCR检测结果为阳性的样品,但后两种方法均未检测出阳性样品中的CIAV。根据整个试验结果推断:CIAV M突变株不能在df-1上适应性生长,其可能不具有特殊的df-1细胞系嗜性。

关键词：鸡传染性贫血病毒 CIAV M突变株致病性 df-1细胞系生长适应性

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3种花色苷对df-1细胞的影响

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生物技术通讯 2012年第4期23卷 542-545页

作者：盖丽丽张莉姜世金雷用东山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097 石河子大学新疆石河子83200

目的:探讨来自心里美萝卜、紫甘薯和紫玉米的3种不同的花色苷对df-1细胞单层生长的影响。方法:直观观察3种花色苷对df-1细胞生长的影响,初步摸索其最适终浓度;用MTT法检测花色苷在提高细胞活性方面的作用。结果:不同浓度的3种花色苷均... 详细信息

目的:探讨来自心里美萝卜、紫甘薯和紫玉米的3种不同的花色苷对df-1细胞单层生长的影响。方法:直观观察3种花色苷对df-1细胞生长的影响,初步摸索其最适终浓度;用MTT法检测花色苷在提高细胞活性方面的作用。结果:不同浓度的3种花色苷均对细胞单层生长有不同的影响,心里美萝卜花色苷、紫甘薯花色苷和紫玉米花色苷对细胞生长的最适终浓度分别为100、75和50μg/mL;用MTT法获得相应数据并制成细胞活性图表。结论:不同品种来源及不同浓度的花色苷对df-1细胞单层生长均有明显影响,为今后开展花色苷促细胞生长,提高细胞抗病毒活性研究提供了数据基础。

关键词：花色苷 df-1细胞系生长 MTT实验

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