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The regulatory roles of ddit4 in TDCIPP-induced autophagy and apoptosis in PC12 cells

Journal of Environmental Sciences 2023年第3期125卷 823-830页

作者： Li Li Lingyi Xi JinWu Zunquan Zhao Youliang Chen Weili Liu Zhihui Pan Mingzhu Liu Danfeng Yang Zhaoli Chen Yanjun Fang Tianjin Institute of Environmental and Operational Medicine Tianjin 300050China Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University Luoyang 471000China School of Food and Biological Engineering Shaanxi University of Science and TechnologyXi’an 710021China China Academy of Safety Science and Technology Beijing 100012China

Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate(TDCIPP) is a commonly used organophosphatebased flame retardant and can bio-accumulate in human tissues and organs. As its structure is similar to that of neurotoxic organophosphate pesticides, the neurotoxicity of TDCIPP has raised widespread concerns. TDCIPP can increase neuronal apoptosis and induce ***, its regulatory mechanism remains unclear. In this study, we found that the expression upregulation of the DNA Damage-Inducible Transcript 4(ddit4) protein, which might play essential roles in TDCIPP-induced neuronal autophagy and apoptosis, was observed in TDCIPP-treated differentiated rat PC12 cells. Furthermore, we determined the protective effect of the ddit4 suppression on the autophagy and apoptosis induced by TDCIPP using Western blot(WB) and Flow cytometry(FACS) analysis. We observed that TDCIPP treatment increased the ddit4, the autophagy marker Beclin-1, and the microtubule-associated protein light chain 3-II(LC_(3)II) expressions and decreased the mTOR phosphorylation levels. Conversely, the suppression of ddit4 expression increased the p-mTOR expression and decreased cell autophagy and apoptosis. Collectively, our results revealed the function of ddit4 in cell death mechanisms triggered by TDCIPP through the m TOR signaling axis in differentiated PC12 cells. Thus, this study provided vital evidence necessary to explain the mechanism of TDCIPP-induced neurotoxicity in differentiated PC12 cells.

关键词： TDCIPP ddit4 Autophagy Neurotoxicity

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Loss of the vitamin D receptor triggers senescence in chronic myeloid leukemia via ddit4-mediated DNA damage

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Journal of Molecular Cell Biology 2023年第10期15卷 65-76页

作者： Yan Xu Wentao Qi Chengzu Zheng Yuan Li Zhiyuan Lu Jianmin Guan Chunhua Lu Baobing Zhao Key Lab of Chemical Biology(MOE) School of Pharmaceutical SciencesCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinan 250012China NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products School of Pharmaceutical SciencesCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinan 250012China Department of Pharmacology School of Pharmaceutical SciencesCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinan 250012China School of Pharmaceutical Sciences&Institute of Materia Medica Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical SciencesJinan 250012China Department of Hematology Heze Municipal HospitalHeze 274031China

Chronic myeloid leukemia(CML)is a hematopoietic malignancy driven by the fusion gene BCR::*** resistance to tyrosine kinase inhibitors(TKIs),due to BCR::ABL1 mutations and residual leukemia stem cells(LSCs),remains a major challenge in CML ***,we revealed the requirement of the vitamin D receptor(VDR)in the progression of *** was upregulated by BCR::ABL1 and highly expressed in CML ***,VDR knockdown inhibited the proliferation of CML cells driven by both BCR::ABL1 and TKI-resistant BCR::ABL1 ***,VDR transcriptionally regulated ddit4 expression;reduced ddit4 levels upon VDR knockdown triggered DNA damage and senescence via p53 signaling activation in CML ***,VDR deficiency not only suppressed tumor burden and progression in primary CML mice but also reduced the self-renewal capacity of ***,our study demonstrated that targeting VDR is a promising strategy to overcome TKI resistance and eradicate LSCs in CML.

关键词： vitamin D receptor senescence chronic myeloid leukemia ddit4

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ddit4对A549细胞增殖迁移的影响及其机制

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中华肿瘤防治杂志 2022年第20期29卷 1460-1466页

作者：栾艳超彭海军韩青松白峰王明正河北省胸科医院胸外科河北省肺病重点实验室河北石家庄050001

目的探讨DNA损伤诱导转录因子4(ddit4)在肺腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖、凋亡的影响和可能机制。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测ddit4在肺腺癌细胞系(H1299和A549)及正常肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)中表达;慢病毒转... 详细信息

目的探讨DNA损伤诱导转录因子4(ddit4)在肺腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖、凋亡的影响和可能机制。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测ddit4在肺腺癌细胞系(H1299和A549)及正常肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)中表达;慢病毒转染抑制A549细胞中ddit4表达,分为ddit4敲低慢病毒(sh-ddit4,分为sh-ddit4#1、sh-ddit4#2和sh-ddit4#3)组和转染空病毒(NC)组。蛋白质印迹检测细胞中ddit4沉默效果;CCK-8、平板克隆形成实验检测sh-ddit4对肺腺癌细胞增殖能力的影响;TUNEL凋亡实验检测sh-ddit4对肺腺癌细胞凋亡能力的影响;Transwell和划痕实验检测sh-ddit4对肺腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果qRT-PCR结果显示,ddit4 mRNA在BEAS-2B、H1299和A549细胞中相对表达水平分别为1.01±0.04、2.19±0.09和3.10±0.09,差异有统计学意义,F=183.00,Pddit4蛋白在BEAS-2B、H1299和A549中表达水平分别为0.39±0.02、0.98±0.01和1.00±0.02,差异有统计学意义,F=457.00,Pddit4mRNA在NC、sh-ddit4#1、sh-ddit4#2和sh-ddit4#3组中表达量分别为1.01±0.02、0.58±0.02、0.59±0.02和0.27±0.04,差异有统计学意义,F=150.40,Pddit4蛋白在各组中表达量分别为1.12±0.01、0.61±0.02、0.62±0.02和0.23±0.05,差异有统计学意义,F=145.10,Pddit4组细胞生长率分别为0.91±0.04和0.57±0.01,差异有统计学意义,t=7.71,Pddit4组细胞克隆形成数量分别为120.70±6.64和10.67±0.88,差异有统计学意义,t=16.42,Pddit4组细胞的EdU阳性率分别为(64.33±1.76)%和(13.33±1.20)%,差异有统计学意义,t=23.89,Pddit4组细胞凋亡率分别为(22.33±1.45)%和(49.67±0.88)%,差异有统计学意义,t=16.08,Pddit4组细胞愈合度分别(84.33±1.86)%和(44.67±2.03)%,差异有统计学意义,t=14.43,Pddit4组穿过小室的细胞数量分别为为(118.00±3.79)和(28.00±1.73)个,差异有统计学意义,t=21.62,Pddit4在肺腺癌细胞中表达上调,沉默ddit4表达可抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,诱导细胞凋亡。

关键词：肺肿瘤腺癌细胞增殖细胞凋亡细胞运动 ddit4

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ddit4 mediates the proliferation-promotive effect of IL-34 in human monocytic leukemia cells

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Blood Science 2021年第2期3卷 48-56页

作者： Xiaoqian Lv Yuting Hu Lina Wang Dongyue Zhang Hao Wang Yibo Dai Xiaoxi Cui Guoguang Zheng State Key Laboratory of Experimental Hematology National Clinical Research Center for Blood DiseasesInstitute of Hematology&Blood Diseases HospitalChinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College288 Nanjing RoadTianjin 300020China

Interleukin 34(IL-34)is a cytokine that shares the receptor with colony-stimulating factor 1(CSF-1).IL-34 is involved in a broad range of pathologic processes including *** previously demonstrated that IL-34 promoted the proliferation and colony formation of human acute monocytic leukemia(AMoL)***,the mechanism has not been ***,by analyzing the gene profiles of Molm13 and THP1 cells overexpressing IL-34(Molm13-IL-34 and THP1-IL-34),upregulation of the DNA damageinducible transcript 4(ddit4)was detected in both *** of ddit4 effectively inhibited the proliferation,promoted apoptosis and colony formation in Molm13-IL-34 and THP1-IL-34 *** results suggest that ddit4 mediates the proliferationpromotive effect of IL-34 whereas does not mediate the promotive effect of IL-34 on colony formation in AMoL cells.

关键词： IL-34 ddit4 Monocytic leukemia Proliferation

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miR-222通过下调ddit4抑制肾癌细胞自噬

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中国癌症杂志 2015年第3期25卷 161-166页

作者：倪晓辰赵志红马永良任宗涛刘彬张爱莉河北医科大学第四医院泌尿外科河北石家庄050011

背景与目的:微小RNA(microRNA,miRNA,miR)在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用。miR-222在多种肿瘤组织中表达上调,而其在肾癌(renal cell carcinoma,RCC)中的表达及其作用机制尚不清楚。本研究拟通过检测RCC组织及相应癌旁组织中miR-22... 详细信息

背景与目的:微小RNA(microRNA,miRNA,miR)在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用。miR-222在多种肿瘤组织中表达上调,而其在肾癌(renal cell carcinoma,RCC)中的表达及其作用机制尚不清楚。本研究拟通过检测RCC组织及相应癌旁组织中miR-222的表达情况,探讨miR-222在RCC中的作用。并在体外条件下,通过检测miR-222的下游作用靶点,探讨miR-222的抗RCC作用机制。方法:采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测RCC组织和癌旁组织中miR-222的表达;采用CCK-8法检测细胞的增殖活力;采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测ddit4蛋白及LC3-Ⅱ的表达;采用荧光素酶实验验证miR-222的作用靶点;转染EGFF-LC3后在激光共聚焦显微镜下观察细胞自噬状态。结果:qRTPCR检测结果显示,miR-222在RCC组织中表达明显上调。在人肾透明细胞癌786-O细胞株中敲低miR-222表达后显著抑制细胞的增殖活力,而过表达miR-222可增强786-O细胞的增殖活力(Pddit4蛋白的表达显著上调,过表达miR-222后,ddit4表达明显下调。荧光素酶实验结果表明,ddit4为miR-222的直接作用靶点。RCC组织的ddit4表达下调。在786-O细胞中抑制miR-222表达后,LC3-Ⅱ的表达水平显著上调,自噬体数目显著增加。结论:miR-222在RCC中高表达,并可能通过靶向抑制ddit4的表达参与调控RCC细胞自噬。

关键词： miR-222 肾癌 ddit4 自噬

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ddit4通过PPAR—γ介导的脂肪酸摄入进而促进胰腺癌侵袭和转移的机制研究

DDIT4通过PPAR—γ介导的脂肪酸摄入进而促进胰腺癌侵袭和转移的...

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作者：丁法典福建医科大学

学位级别：硕士

目的:胰腺癌是威胁我国居民健康的主要高致命性癌症,是恶性度最高的肿瘤之一。胰腺癌肿瘤细胞具有明显的代谢重编程的特征,但是,目前仍缺乏有效的治疗手段。DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage-inducible transcript 4,ddit4)是肿瘤代谢... 详细信息

目的:胰腺癌是威胁我国居民健康的主要高致命性癌症,是恶性度最高的肿瘤之一。胰腺癌肿瘤细胞具有明显的代谢重编程的特征,但是,目前仍缺乏有效的治疗手段。DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage-inducible transcript 4,ddit4)是肿瘤代谢相关蛋白,参与多种类型肿瘤的增殖和凋亡。我们研究的目的是阐明ddit4在胰腺癌中的角色,阐明ddit4对胰腺癌调控的机制。方法:我们对2017～2020年就诊我院行手术治疗的胰腺癌患者进行脂质相关临床资料的收集和分析。为了进一步明确ddit4是否参与胰腺癌组织的脂代谢,我们收集符合入组标准的胰腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤旁组织,建立野生型胰腺癌动物模型和ddit4-HET胰腺癌动物模型。通过免疫组化和Western blot检测ddit4在胰腺癌患者和动物模型的肿瘤组织中的表达,通过HE染色和油红O染色比较胰腺癌组织和癌旁组织脂肪浸润程度,同时,比较野生型胰腺癌动物模型和ddit4-HET胰腺癌动物模型的胰腺癌组织的脂肪浸润程度。采用Western blot和免疫组化方法验证了ddit4/PPAR-γ及其下游CD36和ATGL的蛋白表达水平。最后,为了进一步明确ddit4介导的脂代谢异常对胰腺癌组织的影响,我们在野生型胰腺癌动物模型和ddit4-HET胰腺癌动物模型分别检测了胰腺癌组织的凋亡和增殖水平。结果:我们通过对临床资料进行分析发现胰腺癌患者血清中总胆固醇异常者为15/76(19.7%),甘油三酯异常者为26/76(34.2%),高密度脂蛋白胆固醇异常者为48/76(63.2%),低密度脂蛋白胆固醇异常者为16/76(21.1%),极低密度脂蛋白胆固醇异常者为24/76(31.6%),载脂蛋白A1异常者为58/76(76.2%),载脂蛋白B异常者为27/76(35.5%)。免疫组化和Western blot的结果证实了ddit4在胰腺癌中的表达低于癌旁组织,临床样本和动物模型的油红O染色证明胰腺癌组织中脂肪浸润程度大于对照组,ddit4-HET胰腺癌动物模型中胰腺癌肿瘤的脂肪浸润程度高于野生型胰腺癌肿瘤。有趣的是,我们通过Western blot、免疫荧光和免疫组化发现了ddit4-HET胰腺癌动物模型中PPAR-γ及其下游蛋白CD36和ATGL的表达明显增高。最后,免疫组化和免疫荧光的结果支持ddit4-HET胰腺癌动物模型中ki-67的表达水平明显增加,caspase-3的表达水平降低。结论:1.胰腺癌临床患者血清学中脂质相关蛋白的表达水平有较高比例的异常。***4在胰腺癌组织中表达较低,并且其参与了胰腺癌肿瘤组织的脂代谢过程。***4通过PPAR-γ及其下游蛋白CD36和ATGL调节胰腺癌细胞的脂代谢和胰腺癌侵袭和转移。

关键词：胰腺癌 ddit4 脂肪浸润 PPAR-γ 增殖

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ddit4在邻苯二甲酸二异壬酯诱导卵巢颗粒细胞自噬中的作用及机制研究

DDIT4在邻苯二甲酸二异壬酯诱导卵巢颗粒细胞自噬中的作用及机制...

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作者：王亦婧南昌大学

学位级别：硕士

目的:邻苯二甲酸二异壬酯(Di-isononyl phthalate,DINP)是属于邻苯二甲酸酯类(Phthalates,PAEs)中的一种,在工业生产中常被用为增塑剂。DINP进入人体的方式主要包括口腔摄入、皮肤接触和呼吸道吸入,并在人体的尿液、血液中均可检测到。... 详细信息

目的:邻苯二甲酸二异壬酯(Di-isononyl phthalate,DINP)是属于邻苯二甲酸酯类(Phthalates,PAEs)中的一种,在工业生产中常被用为增塑剂。DINP进入人体的方式主要包括口腔摄入、皮肤接触和呼吸道吸入,并在人体的尿液、血液中均可检测到。我们的前期研究发现DINP可引起卵巢颗粒细胞自噬,然而DINP诱导卵巢颗粒细胞自噬的分子机制尚不清楚。因此本研究旨在探究ddit4(DNA damage inducing transcript 4)在DINP诱导卵巢颗粒细胞自噬中的作用,并揭示其调控机制。方法:1.使用0-200 mg/kg浓度的DINP对雌性小鼠灌胃处理两周后,用免疫组织化学检测卵巢组织中LC3B的表达。2.使用0-800μM浓度的DINP处理人卵巢颗粒细胞KGN细胞系24 h,并使用CCK-8法测定活性。提取各组蛋白后,使用Western blot检测细胞自噬蛋白水平。3.将KGN细胞分别用DINP(0,800μM)处理24 h后,固定细胞,使用透射电镜观察KGN细胞内自噬泡数量的变化。4.使用0-200 mg/kg浓度的DINP对雌性小鼠灌胃处理两周后,用免疫组织化学的方法检测卵巢组织中ddit4的表达。5.采用qPCR和Western blot检测DINP对KGN细胞中ddit4表达的影响。6.构建pcDNA3.1-ddit4质粒,并将其转染进KGN细胞48 h后用Western blot检测细胞内自噬蛋白水平的变化;敲减KGN细胞内ddit4后,再分别用或者不用800μM浓度的DINP处理细胞,用Western blot再次检测KGN细胞自噬蛋白水平的变化。7.将pcDNA3.1-ddit4质粒转染进KGN细胞48 h后,固定细胞,采用透射电镜观察细胞内自噬泡数量的变化。8.用JASPAR网站进行预测,发现在ddit4基因的上游启动子区域存在ATF4的假定结合位点。设计引物用于扩增包含KGN细胞的ddit4启动子区质粒(p GL4.2-ddit4prom、p GL4.2-RE1、p GL4.2-RE2、p GL4.2-RE3),使用点突变试剂盒构建RE2位点突变质粒(p GL4.2-Mut RE2)。将上述质粒与pcDNA3.1-ATF4质粒转染进KGN细胞后,测定细胞的荧光素酶活性。用2×10～6个KGN细胞进行染色质免疫共沉淀实验,分别用ATF4抗体和Ig G抗体沉淀细胞核裂解液后,使用Ch IP-qPCR鉴定沉淀所得的DNA。9.构建pcDNA3.1-ATF4质粒,并将其转染进KGN细胞后,分别用qPCR和Western blot检测ATF4过表达对细胞内ddit4的m RNA和蛋白表达的影响;敲减KGN细胞的ATF4后,再分别用qPCR和Western blot检测细胞内ddit4的m RNA和蛋白含量。10.使用0-200 mg/kg浓度的DINP对雌性小鼠灌胃处理两周后,使用免疫组织化学的方法检测卵巢组织中ATF4的表达。11.分别用qPCR和Western blot检测DINP对KGN细胞中ATF4表达水平的影响。12.在敲减或不敲减KGN细胞内的ATF4后,再用800μM浓度的DINP处理细胞,分别检测细胞内ddit4的m RNA和蛋白水平。13.将pcDNA3.1-ATF4质粒转染进KGN细胞48 h后,固定细胞,采用透射电镜观察细胞内自噬泡数量。过表达KGN细胞中的ATF4后,用Western blot检测ATF4对自噬蛋白水平的影响;敲减KGN细胞中的ATF4,用Western blot检测自噬蛋白水平。在敲减或不敲减KGN细胞中ATF4的情况下,再用800μM浓度的DINP处理,用Western blot检测细胞自噬蛋白水平。结果:1.免疫组织化学结果显示DINP可增加小鼠卵巢组织中颗粒细胞内LC3B的含量,说明DINP可诱导卵巢颗粒细胞发生自噬。CCK-8结果显示,200,400和800μM浓度的DINP可显著抑制KGN细胞活性;同时Western blot结果显示,DINP可明显提高KGN细胞的自噬程度。透射电镜结果也发现DINP处理组中的自噬泡数量明显多于对照组。综合表明DINP可诱导卵巢颗粒细胞自噬。2.免疫组织化学结果显示DINP可增加小鼠卵巢组织中颗粒细胞内ddit4的含量,说明DINP可促进卵巢组织颗粒细胞内ddit4的表达。qPCR和Western blot结果显示,DINP可促进KGN细胞中ddit4的m RNA和蛋白表达。上述结果均显示DINP可诱导卵巢颗粒细胞内ddit4的表达。*** blot结果显示,过表达ddit4可增加KGN细胞内LC3-II、At

关键词：邻苯二甲酸二异壬酯卵巢颗粒细胞自噬 ATF4 ddit4

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ddit4介导IL-34对AMoL细胞的促增殖作用

DDIT4介导IL-34对AMoL细胞的促增殖作用

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作者：吕晓倩北京协和医学院

学位级别：硕士

目的:白细胞介素34（IL-34）是2008年发现的39kD的造血细胞因子[1],是髓系细胞（包括单核细胞,巨噬细胞和破骨细胞）存活增殖和分化的关键调节因子,与巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF;也称 colony st... 详细信息

目的:白细胞介素34（IL-34）是2008年发现的39kD的造血细胞因子[1],是髓系细胞（包括单核细胞,巨噬细胞和破骨细胞）存活增殖和分化的关键调节因子,与巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF;也称 colony stimulating factor 1,CSF1）作用于同一受体,即CSF1R。IL-34表达广泛,在脾脏、皮肤和脑中表达较高,而且在心脏,肺,肝,肾,脾,胸腺,睾丸,卵巢,小肠,前列腺和结肠均有表达[2]。在生理条件下,IL-34可以促进单核细胞在血液系统中的存活,促进单核细胞的增殖和分化[3,4],维持巨噬细胞的功能,参与各种组织的发育过程[5-8]。大量研究表明,IL-34还参与了从炎症、自身免疫到癌症的各种病理[2]。但在血液系统恶性肿瘤尤其是白血病中IL-34的作用研究较少。因此实验室前期通过构建过表达IL-34的急性单核细胞白血病（AMoL）细胞系,发现IL-34可以促进AMoL的增殖和克隆形成能力。然而,IL-34影响AMoL细胞系恶性生物学行为的具体机制仍不清楚。通过RNA-Seq分析过表达IL-34的AMoL细胞系的转录组数据,发现ddit4在过表达IL-34的AMoL细胞系表达上调。因此我们希望在过表达IL-34的AMoL细胞系敲降ddit4探究ddit4是否参与了 IL-34促进AMoL细胞的增殖。方法:构建ddit4敲降载体pLV-RNAi。制备ddit4敲降慢病毒,感染过表达IL-34的人AMoL细胞系Molm13和THP1。通过体外细胞增殖实验、PI染色检测细胞周期法、Annexin-V/PI检测细胞凋亡的方法探究ddit4在过表达IL-34的白血病细胞中对白血病细胞增殖、凋亡的影响;通过集落形成实验探究ddit4在过表达IL-34的白血病细胞中对白血病细胞干性的影响;通过流式抗体染色分析实验探究ddit4在过表达IL-34的白血病细胞对白血病细胞分化表型的影响。结果:为探究ddit4是否参与了 IL-34促进AMoL细胞的恶行生物学行为,我们在过表达IL-34的AMoL细胞系Molm13和THP1中敲降ddit4,荧光定量PCR（RT-PCR）鉴定sh1和sh2组ddit4表达水平较sc组降低,表明已成功构建敲降ddit4的Molm13-IL-34和THP1-IL-34细胞系。通过体外实验表明敲降ddit4显著抑制 Molm13-IL-34 和 THP1-IL-34 细胞的增殖,促进 Molm13-IL-34 和 THP1-IL-34细胞凋亡和集落形成能力（均P＜0.05）。除此之外,ddit4的敲降对于Molm13-IL-34和THP1-IL-34的单核-巨噬分化没有显著影响。结论:ddit4参与调控IL-34促进AMoL细胞的增殖作用

关键词： ddit4 AMoL细胞增殖

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ddit4基因单核苷酸多态性及其在PBMCs中的表达水平与系统性红斑狼疮的相关性研究

DDIT4基因单核苷酸多态性及其在PBMCs中的表达水平与系统性红斑狼...

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作者：胡玉倩安徽医科大学

学位级别：硕士

目的系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种由于免疫系统受损导致的多器官障碍的复杂疾病。DNA损伤诱导转录子4(DNA damage inducible transcript 4,ddit4)基因与细胞应对各种压力源(如缺氧,能量消耗等)的反应有关,... 详细信息

目的系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种由于免疫系统受损导致的多器官障碍的复杂疾病。DNA损伤诱导转录子4(DNA damage inducible transcript 4,ddit4)基因与细胞应对各种压力源(如缺氧,能量消耗等)的反应有关,最突出的是其能抑制哺乳动物雷帕霉素靶点的活性,并因此参与调控多种细胞过程。最近的研究结果表明ddit4基因与自身免疫性疾病有关联,但与SLE的相关研究较少。本研究的主要内容包括ddit4基因单核苷酸多态性与SLE遗传性和表型之间的关联,以及该基因在不同研究组之间的表达水平是否有差异,并分析探讨ddit4基因与SLE患者临床特征的关联,为疾病的病因学研究提供依据。方法本研究采用病例对照研究设计,共纳入SLE病人592例和健康对照587例。第一部分,利用多重高温连接酶检测反应技术(improved multiple ligase detection reaction,i MLDR)进行基因分型并分析ddit4基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点(rs877767、rs8316、rs4747241)与SLE的遗传易感性以及临床特征之间的关联。第二部分,我们在上述研究对象中选取SLE病人99例和健康对照98例,实时荧光定量聚合酶链式反应用于检测ddit4基因在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的表达水平,分析该基因在不同研究组之间表达水平的差异,并探讨基因表达水平与临床表型及实验室指标之间的关联。结果(1)ddit4基因三个位点(rs877767、rs8316、rs4747241)的基因型和等位基因频率在两组之间的差异均无统计学意义(均有P>0.05),且其不同遗传模型(显性模型、隐性模型和相加模型等)在两组之间也无统计学差异(均有P>0.05)。此外,位点rs877767的基因型和等位基因频率分布在不同临床表现之间的差异无统计学意义(均有P>0.05),但位点rs8316等位基因频率的分布以及位点rs4747241基因型频率和等位基因频率在SLE是否伴有口腔溃疡患者中有统计学差异((?)=5.715,P=0.017,(?)=8.783,P=0.012,(?)=9.897,P=0.002)。(2)SLE病例与健康对照两组中ddit4基因的PBMCs表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。此外,ddit4表达水平与临床表现和实验室指标之间的关联也没有统计学意义(均有P>0.05)。结论ddit4基因(rs877767、rs8316、rs4747241)多态性与SLE的遗传易感性无统计学关联,且该基因在PBMCs中的表达水平在病例组与对照组之间也无统计学差异,位点rs8316和rs4747241多态性与疾病伴有口腔溃疡有联系。

关键词：系统性红斑狼疮 ddit4 单核苷酸多态性表达水平

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糖尿病肾病中CREB/miR-22/ddit4通路促进肾小管上皮细胞DNA损伤的实验研究

糖尿病肾病中CREB/miR-22/DDIT4通路促进肾小管上皮细胞DNA损伤的...

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作者：赵思琪贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:DNA损伤和糖尿病肾病发生发展密切相关,但具体机制尚不明确,本研究旨在探究CREB/miR-22/ddit4通路在糖尿病肾病中促进肾小管上皮细胞DNA损伤的具体机制,以期进一步阐明糖尿病肾病的发病机制,为防治DN寻找新的有效靶点。方法:(1)用C... 详细信息

目的:DNA损伤和糖尿病肾病发生发展密切相关,但具体机制尚不明确,本研究旨在探究CREB/miR-22/ddit4通路在糖尿病肾病中促进肾小管上皮细胞DNA损伤的具体机制,以期进一步阐明糖尿病肾病的发病机制,为防治DN寻找新的有效靶点。方法:(1)用C57BL小鼠建立糖尿病肾病模型,16周后处死,分析其生化指标并对肾脏组织做HE染色观察,通过western blot技术检测肾脏组织中的ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平和ddit4、p-CREB的蛋白表达水平。(2)分别用高糖培养基和正常糖培养基培养肾小管上皮细胞(NRK-52E)细胞,通过彗星实验检测DNA双链断裂程度,通过细胞流式技术检测细胞周期的影响,通过western blot技术检测细胞中的ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平和ddit4、CREB磷酸化水平。(3)构建ddit4过表达质粒,转染质粒后通过彗星实验检测过表达ddit4对DNA双链断裂的影响,通过western blot技术检测细胞中的ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平和ddit4的蛋白表达水平。(4)通过miRanda和TargetScan预测miR-22对ddit4的靶向调控作用。(5)构建miR-22模拟物(mimics),转染miR-22 mimics后通过彗星实验检测过表达miR-22对DNA双链断裂的影响,通过western blot技术检测过表达miR-22对ddit4蛋白表达和ATM、Chk2磷酸化的影响。(6)通过clustalX2软件预测CREB与miR-22的启动子结合位点,并构建luciferase报告质粒和CREB过表达质粒,在NRK-52E细胞中过表达CREB后通过luciferase实验和q-PCR实验验证CREB对miR-22的调控作用。(7)在NRK-52E细胞中过表达CREB之后用western blot技术检测对ddit4蛋白表达的影响,用细胞流式技术检测对细胞周期的影响。结果:(1)糖尿病肾病小鼠肾脏中ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平增高,ddit4蛋白表达水平下降,p-CREB表达水平增高。(2)高糖培养的NRK-52E细胞比正常糖培养的细胞彗尾更长,ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平增高,ddit4蛋白表达水平下降,p-CREB表达水平增高。(3)高糖培养的NRK-52E细胞过表达ddit4后ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平降低,NRK-52E细胞彗尾变短。(4)软件预测表明miR-22能靶向调控ddit4。(5)过表达miR-22的细胞相对于未过表达miR-22的细胞彗尾更长,ATM磷酸化水平、Chk2磷酸化水平增高,ddit4蛋白表达水平下降。(6)过表达CREB后luciferase荧光活性变强,miR-22表达增加。(7)在细胞中过表达CREB后ddit4的蛋白表达下降。结论:(1)体内外高糖环境可以导致DNA损伤加重。(2)高糖条件下大鼠肾小管上皮细胞中ddit4的表达降低,过表达肾小管上皮细胞中的ddit4可以减轻DNA损伤;(3)高糖环境中大鼠肾小管上皮细胞中CREB磷酸化水平增高,并可能通过靶向调控miR-22使ddit4表达下调,从而诱导肾小管上皮细胞DNA损伤,促进了糖尿病肾病的发生发展。

关键词： DNA损伤 CREB miR-22 ddit4 糖尿病肾病

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