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CRISPR/Cas9技术敲除杨树dcl1基因表达载体的构建

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中文科技期刊数据库（全文版）农业科学 2019年第11期 95-98页

作者：杨雪刘保国河南科技大学林学院河南洛阳471023

以 84K 杨为材料,扩增其基因组 DNA 第 1 个外显子序列,设计 2 个 gRNA 靶点,利用酶切连接方法将其连入 sgRNA 克隆框,利用巢式 PCR 技术扩增获得包含 2 个靶点的表达盒扩增产物,进一步使用 Bsa I 内切酶线性化 pYLCRISPR/Cas9-DH 载体... 详细信息

以 84K 杨为材料,扩增其基因组 DNA 第 1 个外显子序列,设计 2 个 gRNA 靶点,利用酶切连接方法将其连入 sgRNA 克隆框,利用巢式 PCR 技术扩增获得包含 2 个靶点的表达盒扩增产物,进一步使用 Bsa I 内切酶线性化 pYLCRISPR/Cas9-DH 载体,并使用 T4 DNA 连接酶连入表达盒扩增产物,成功构建杨树 dcl1 基因编辑载体 pYLCRISPR/Cas9-DH–Ptdcl1。

关键词： 84K杨 CRISPR/Cas9 dcl1 基因编辑

拟南芥dcl1启动子的分离及其表达特性分析

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中国农业科技导报 2010年第3期12卷 98-102页

作者：李微微李川罗彦忠郁建平王磊贵州大学生命科学学院生化营养研究所贵阳550025 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

Dicer酶是类似于RNaseⅢ的核酸内切酶,能够特异性地将双链RNA剪切成约20nt的小RNA,在基因沉默途径中起到非常重要的作用。从拟南芥中分离出dcl1基因上游启动子序列2kb及dcl1基因的5′端1kb序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物... 详细信息

Dicer酶是类似于RNaseⅢ的核酸内切酶,能够特异性地将双链RNA剪切成约20nt的小RNA,在基因沉默途径中起到非常重要的作用。从拟南芥中分离出dcl1基因上游启动子序列2kb及dcl1基因的5′端1kb序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,并对转基因植株进行GUS组织化学染色及荧光定量分析,结果表明,在dcl1基因启动子的驱动下,报告基因GUS主要在拟南芥的叶片中表达,在幼嫩的叶片及茎尖中表达量也比较高,茎中的表达量较低,在根中只有微量的表达。

关键词：拟南芥基因沉默 dcl1 小RNA 启动子 GUS染色

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盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究

盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究

中国植物病理学会2011年学术年会

作者：曾丽斯谢甲涛姜道宏付艳苹程家森湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学

微小RNA（miRNA,microRNA）是由具有发夹结构的初级转录本（pri-miRNA）经过一系列加工过程而产生的一种非编码小RNA,广泛存在于高等和低等生物体内,通过剪切靶标mRNA直接切除或抑制其翻译调控基因表达。Dicer酶在miRNA的加工过程中起... 详细信息

微小RNA（miRNA,microRNA）是由具有发夹结构的初级转录本（pri-miRNA）经过一系列加工过程而产生的一种非编码小RNA,广泛存在于高等和低等生物体内,通过剪切靶标mRNA直接切除或抑制其翻译调控基因表达。Dicer酶在miRNA的加工过程中起重要作用,AGO蛋白则是小RNA行使功能的RNA诱导沉默复合体（RNA inducedsilencing complex,RISC）中的重要成员。目前研究表明miRNA在动植物的生长发育等过程中起重要的调控作用,有关上述小RNA通路相关基因在动植物以及部分真菌中的功能也有研究报道,但在核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的生防菌盾壳霉（Coniothyriumminitans）中这些基因的功能均不明确,本文对盾壳霉中的AGO、dcl1及dcl2基因的功能进行了相关研究。首先通过RT-PCR检测了AGO、dcl1和dcl2基因在盾壳霉中的表达情况,发现这些基因在盾壳霉的生长和产孢等阶段均有表达。根据同源重组的原理构建了这三个基因的敲除载体,通过农杆菌介导转化盾壳霉分生孢子,经PCR和Southern杂交验证分别得到了3个AGO基因敲除转化子,4个dcl1基因敲除转化子和8个dcl2基因敲除转化子,RT-PCR检测结果表明这些敲除转化子中相关基因均无表达。进一步研究表明,在PDA培养基上生长时,敲除转化子所形成的菌落形态、菌丝形态和孢子形态等方面与野生菌株ZS-1相比均无显著差异。但是,它们的生长速度和产孢量均显著高于野生菌株ZS-1;AGO基因敲除转化子的寄生腐烂菌核能力强于野生菌株ZS-1,而dcl1和dcl2基因敲除转化子的寄生腐烂菌核能力要显著低于野生ZS-1;上述研究结果初步表明AGO、dcl1和dcl2基因对盾壳霉的生长、孢子发育和寄生菌核能力等具有一定的调控作用,有关这些基因在盾壳霉中的详细功能,如在调控盾壳霉的小RNA加工及行使功能等方面的作用有待于进一步研究。

关键词：盾壳霉小RNA AGO dcl1 dcl2

来源： cnki会议评论

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盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究

盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究

作者：曾丽斯华中农业大学

学位级别：硕士

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Scleroinia sclerotiorum)的重寄生真菌。小RNA调控通路广泛存在于高等和低等生物体内,其中Dicer酶在小RNA的加工过程中起重要的剪切作用,AGO蛋白则是小RNA行使功能的RNA诱导沉默复合... 详细信息

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Scleroinia sclerotiorum)的重寄生真菌。小RNA调控通路广泛存在于高等和低等生物体内,其中Dicer酶在小RNA的加工过程中起重要的剪切作用,AGO蛋白则是小RNA行使功能的RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)中的重要成员。这些基因在动植物以及部分真菌中的功能已有研究报道,但在盾壳霉中这些基因的功能尚不明确,本文对盾壳霉的AGO、dcl1及dcl2基因的功能进行了相关研究。首先我们通过RT-PCR证实了CmAGO、Cmdcl1和Cmdcl2在盾壳霉的生长和产孢等阶段均有表达。根据同源重组的原理构建了这三个基因的敲除载体,通过农杆菌介导转化盾壳霉分生孢子,经PCR和Southern杂交验证分别得到了3个CmAGO敲除转化子,4个Cmdcl1敲除转化子和8个Cmdcl2敲除转化子。构建了相关基因的互补载体,并得到了3个Cmdcl2基因的互补转化子。进一步研究表明,在PDA培养基上,CmAGO、Cmdcl1和Cmdcl2敲除转化子的菌落、菌丝及孢子形态与出发菌株ZS-1相比均无显著差异,但生长速度、寄生致腐核盘菌菌核能力均显著低于出发菌株ZS-1;产孢量、产抗真菌物质能力均显著高于出发菌株ZS-1;CmAGO敲除转化子孢子萌发速率显著高于出发菌株ZS-1;核盘菌Ep-1PNA367与三个基因敲除转化子对峙培养时,两菌菌丝融合会促进敲除转化子在交界处产孢增加;CmAGO和Cmdcl2敲除转化子与带病毒的灰霉菌Bc10HN454菌株对峙培养可获得病毒,CmAGO和Cmdcl2敲除转化子感染BcHV/10HN454和BcTV/10HN454病毒后,表型发生显著变化,Cmdcl2敲除转化子产孢量明显减少,CmAGO敲除转化子不产孢。Cmdcl2互补转化子在生物学性状各方面测定中均与出发菌株ZS-1无显著差异。上述研究结果表明CmAGO、Cmdcll和Cmdcl2基因在盾壳霉的生长发育和寄生核盘菌等方面发挥重要作用。

关键词：盾壳霉小RNA AGO dcl1 dcl2

苹果树腐烂病菌小RNA生成通路关键基因的功能研究

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苹果树腐烂病菌小RNA生成通路关键基因的功能研究

作者：刘洋洋西北农林科技大学

学位级别：硕士

苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的苹果树腐烂病是目前在中国乃至东亚苹果生产上最具破坏性的真菌病害之一。小分子RNA介导的RNA沉默途径在调节生物体的生长发育及多种生命过程中发挥着重要的作用,而这个途径需要Dicer蛋白和Argonaut... 详细信息

苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的苹果树腐烂病是目前在中国乃至东亚苹果生产上最具破坏性的真菌病害之一。小分子RNA介导的RNA沉默途径在调节生物体的生长发育及多种生命过程中发挥着重要的作用,而这个途径需要Dicer蛋白和Argonaute蛋白的参与。在动植物和一些真菌中,小RNA通路相关基因的功能研究已有报道,但这些基因的功能在苹果树腐烂病菌中尚不清楚。本文通过对小RNA生成通路中的两类关键基因家族dicer-like（dcl）和Argonaute（AGO）进行基因敲除,比较基因敲除突变体与野生型之间的生长表型和致病力差异,探讨dcl和AGO的基因功能,为揭示苹果树腐烂病菌小RNA生成的分子遗传机制奠定基础。本实验研究结果如下:1.通过生物信息学分析,发现苹果树腐烂病菌中存在2种Dicer-like和3种Argonaute。2.根据同源重组原理构建了 VMdcl1、VMdcl2、VMAGO2和VMAGO3四个基因的敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化苹果树腐烂病菌,经过PCR和Southern杂交验证分别得到了 4个VMdcl1敲除突变体,5个VMdcl2敲除突变体,1个VMAGO3敲除突变体以及6个VMAG02敲除突变体。***2基因可能与菌丝的营养生长有关,与野生型相比dcl2敲除突变体的菌丝体产量明显增多;dcl1可能与苹果树腐烂病菌的致病力相关,对苹果富士叶片的侵染结果表明,敲除dcl1后其致病力明显增强,而dcl2基因的缺失对苹果树腐烂病菌的致病力并无明显的影响。***2基因可能与菌丝的生长发育相关,敲除AGO2后菌丝变粗并且分枝减少;AGO3基因可能与繁殖体的形成有关,与野生型03-8相比,AGO3的敲除突变体繁殖体数量明显增多;AGO2和AGO3基因可能与致病力相关,敲除AGO2基因后其致病力明显减弱,而AGO3基因的敲除突变体致病力明显增强。***1、dcl2和AGO2可能参与外界胁迫反应的应答。在过氧化氢胁迫实验中,与野生型03-8相比,dcl1缺失突变体对过氧化氢的耐受性增强,dcl2缺失突变体变得敏感,AGO2的缺失导致其在过氧化氢胁迫下生长明显畸形;在不同渗透压力实验中,dcl1的缺失突变体在高渗透压力条件下变得更加敏感,几乎不生长,而其它基因的缺失突变体没有表现出与野生型03-8明显的差异。

关键词：苹果树腐烂病菌小 RNA dcl1 dcl2 AGO2 AGO3

大豆疫霉菌小RNA通路核心组件的识别分析及其突变体的筛选

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大豆疫霉菌小RNA通路核心组件的识别分析及其突变体的筛选

作者：王蕾西北农林科技大学

学位级别：硕士

卵菌(Oomycetes)是一类形态上与真菌类似,而进化上与藻类极为相近的真核类微生物,也是一类重要的动植物病原菌。其中疫霉属(Phytophthora)的大部分成员都是毁灭性的植物病原菌,在全球范围内造成巨大的经济损失。曾经导致爱尔兰大饥荒的... 详细信息

卵菌(Oomycetes)是一类形态上与真菌类似,而进化上与藻类极为相近的真核类微生物,也是一类重要的动植物病原菌。其中疫霉属(Phytophthora)的大部分成员都是毁灭性的植物病原菌,在全球范围内造成巨大的经济损失。曾经导致爱尔兰大饥荒的致病疫霉菌(Phytophthora infestans),至今仍然是马铃薯产业的最严重病害问题;大豆疫霉菌(Phytophthora sojae )引起的大豆疫霉根腐病是大豆毁灭性病害之一。MicroRNA和siRNA等小分子非编码RNA是近年来发现的重要调控因子,在生物的生长发育和抗逆胁迫等生命活动过程中发挥重要的调节作用。迄今为止,在动物、植物、真菌和病毒中都已有相关小分子RNA的报道,而卵菌中却一直未见相应的报道。因此,识别卵菌小RNA通路中的核心蛋白及其特征,对于研究卵菌小RNA通路的存在情况以及小RNA的生物合成、功能和调控机制都具有重要意义,对全面开展卵菌类病原菌在生物学和病理学方面的研究极具推动作用。大豆疫霉菌是同宗配合,且具有高质量的基因组序列和大量已公布的EST数据,已成为卵菌中的模式种。我们以大豆疫霉菌为实验材料,通过BLAST确定了其dcl(Dicer-like protein)和RDR(RNA-dependent RNA polymerase)等小RNA通路中核心蛋白的同源物;通过Pfam分析表明大豆疫霉菌的dcl1蛋白具有2个RNase III结构域、1个双链RNA结合结构域和1个DEAD结构域,但缺失动植物Dicer/dcl蛋白的PAZ结构域和dsrm模体,因此我们推测卵菌基于dcl蛋白的小RNA产生机制可能与其他真核生物不同。而大豆疫霉菌RDR蛋白候选的确定,表明其具有RNA扩增的潜在机制。本实验室建立了大豆疫霉菌的EMS化学诱变突变体库,为筛选大豆疫霉中小RNA生物合成相关基因的突变体奠定了基础。本实验中主要采用TILLING技术筛选大豆疫霉小RNA通路关键基因的突变体。实验设计上我们对传统的TILLING技术进行了一些改进,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SYBR GREENⅠ染色的方法来检测异源双链经CJE(Celery Juice Extract)处理后的酶切条带,这种方法既简化了实验操作又降低了实验成本。而且经过实验摸索,我们已经初步建立了利用TILLING技术对大豆疫霉菌EMS突变体库的筛选条件,并且获得了Psdcl1基因的候选突变体。

关键词：卵菌大豆疫霉菌小RNA EMS诱变 TILLING技术 dcl1