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小鼠Foxp3基因慢病毒载体构建及其在dc2.4细胞的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第7期27卷 721-724页

作者：宫玉波黄一飞黎燕韩根成刘勇王大江杜改萍余继锋解放军总医院眼科北京100853 军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室北京100850

目的:构建小鼠Foxp3基因的慢病毒载体,体外感染树突状细胞dc2.4,制备Foxp3+dc细胞,为进一步研究其免疫调节作用奠定基础。方法:将小鼠Foxp3基因克隆到慢病毒pGC-FU载体,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。将鉴定后的重组表达质粒pGC... 详细信息

目的:构建小鼠Foxp3基因的慢病毒载体,体外感染树突状细胞dc2.4,制备Foxp3+dc细胞,为进一步研究其免疫调节作用奠定基础。方法:将小鼠Foxp3基因克隆到慢病毒pGC-FU载体,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。将鉴定后的重组表达质粒pGC-FU-Foxp3与pHelper1.0质粒和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,制备携带Foxp3基因的慢病毒Lentivirus-Foxp3。Lentivirus-Foxp3感染体外培养的dc细胞,流式细胞术(FCM)检测感染后的dc细胞Foxp3表达。结果:构建的慢病毒载体pGC-FU-Foxp3经PCR鉴定和测序正确,包装慢病毒Lentivirus-Foxp3滴度为2×108TU/mL。慢病毒Lentivirus-Foxp3感染dc2.4细胞后Foxp3表达明显增加。结论:成功构建了小鼠Foxp3基因的慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-Foxp3能有效感染dc细胞。

关键词： Foxp3 慢病毒 dc2.4

地塞米松对小鼠dc2.4细胞表型及功能的影响

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免疫学杂志 2010年第9期26卷 759-763页

作者：宫玉波黄一飞黎燕韩根成李育蓉王大江杜改萍余继锋宋静解放军总医院眼科北京100853 军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室北京100850

目的研究地塞米松(dexamethasone,Dex)对dc2.4细胞表型及功能的影响。方法取生长状态良好的dc2.4细胞,随机分为4组,A组为对照组;B、C、D组分别为50、100、200μg/L地塞米松组,每组dc2.4细胞培养6d。用流式细胞术测定dc表面CD80,CD86,Gal... 详细信息

目的研究地塞米松(dexamethasone,Dex)对dc2.4细胞表型及功能的影响。方法取生长状态良好的dc2.4细胞,随机分为4组,A组为对照组;B、C、D组分别为50、100、200μg/L地塞米松组,每组dc2.4细胞培养6d。用流式细胞术测定dc表面CD80,CD86,Galectin-9及PD-L1的表达,ELISA方法检测其培养上清IL-12的浓度,用混合淋巴细胞培养法检测其对同种异体T细胞的刺激能力。结果与对照组相比,经不同剂量地塞米松修饰的dc2.4细胞其表面CD80,CD86,Galectin-9及PD-L1的表达无明显改变,但地塞米松用药组显著减少IL-12的分泌及抑制刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论 dc2.4细胞是一细胞表型稳定的细胞系;地塞米松没有明显改变其细胞表型,但抑制其细胞因子的分泌,降低其刺激同种异体反应T细胞增殖的能力。

关键词： dc2.4 半乳糖凝集素-9 程序化死亡因子配体1 地塞米松免疫耐受

青藤碱抑制体外培养dc2.4树突状细胞的生物学活性并减少炎症因子分泌

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第5期31卷 660-663页

作者：王竹王冰冰官菊梅张欣悦王忆梅高永翔成都中医药大学基础医学院四川成都610037

目的观察青藤碱对dc2.4树突状细胞的生物学活性的影响。方法培养dc2.4细胞,根据MTT方法确定药物最佳给药浓度及给药时间,分为正常组、脂多糖(LPS)模型对照组、40μg/m L青藤碱高浓度组、20μg/m L青藤碱组、10μg/m L青藤碱组、25 ng/m ... 详细信息

目的观察青藤碱对dc2.4树突状细胞的生物学活性的影响。方法培养dc2.4细胞,根据MTT方法确定药物最佳给药浓度及给药时间,分为正常组、脂多糖(LPS)模型对照组、40μg/m L青藤碱高浓度组、20μg/m L青藤碱组、10μg/m L青藤碱组、25 ng/m L甲氨蝶呤阳性对照组。5μg/m L LPS刺激dc2.4细胞24 h,给予不同浓度的青藤碱,刺激24、48、72 h,收集细胞上清液,ELISA检测细胞上清液中的γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10、IL-12、CD80的含量。结果不同浓度青藤碱处理各组与甲氨蝶呤处理组均可降低TNF-α、CD80、IFN-γ、IL-6、IL-12的含量,而各处理组的IL-10含量均有所增加,且20μg/m L终浓度青藤碱作用后的TNF-α、CD80、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12的含量相比于其他浓度青藤碱更接近正常组的含量。结论 20μg/m L青藤碱可抑制dc2.4细胞的生物学活性,减少dc的炎症因子分泌。

关键词：青藤碱 dc2.4 类风湿性关节炎

小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建及其在dc2.4的表达

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免疫学杂志 2010年第11期26卷 925-929页

作者：应林燕符州罗健陈艳王莉佳李欣重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心 400014 上海复旦大学附属儿科医院 201102 重庆医科大学附属儿童医院发育疾病研究省部共建教育部重点实验室 400014

目的构建含有小鼠趋化因子受体-7（CCR7）基因的重组腺病毒（AdcCR7）,观察其体外感染dc2.4细胞效率。方法将小鼠CCR7基因克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,在BJ5l83菌内和骨架质粒pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆;经线性化后转染HEK293细胞... 详细信息

目的构建含有小鼠趋化因子受体-7（CCR7）基因的重组腺病毒（AdcCR7）,观察其体外感染dc2.4细胞效率。方法将小鼠CCR7基因克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,在BJ5l83菌内和骨架质粒pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆;经线性化后转染HEK293细胞,获得含小鼠CCR7基因的重组腺病毒AdcCR7;TCID50方法检测病毒滴度,PCR法鉴定病毒DNA。带绿色荧光蛋白腺病毒（AdGFP）和AdcCR7分别感染dc2.4（GFP-dc2.4和CCR7-dc2.4）,同时设未处理dc2.4为空白对照。流式细胞术（FCM）检测各组细胞表面分子CD11c,MHCⅡ,CD86及CCR7表达,趋化实验检测CCR7的功能。结果获得滴度约为l.4×1010pfu/ml重组腺病毒AdcCR7。AdcCR7感染dc2.4后,CCR7-dc2.4组与另外两组细胞比较CD11c、MHCⅡ及CD86的表达均无明显差异,但CCR7表达升高;其对趋化因子CCL19的趋化率可达44.7%~60.0%,明显高于其它两组。结论成功构建含小鼠CCR7基因的重组腺病毒AdcCR7,该病毒可感染细胞株dc2.4,增加细胞表面CCR7表达以及细胞对CCL19的趋化性,为进一步体内实验研究携带CCR7基因的未成熟dcs功能提供了工作基础。

关键词： CCR7 dc2.4 腺病毒

Hlx修饰的树突状细胞系(dc2.4/mHlx)的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第3期26卷 285-287,290页

作者：何志强王胜军薛渊石燕柳迎照仝佳陈建国邵启祥许化溪江苏大学检验医学研究所免疫学研究室江苏镇江212013 江苏大学附属人民医院检验科江苏镇江212001

目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系dc2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定... 详细信息

目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系dc2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定,用脂质体转染dc2.4;应用G418筛选出耐药克隆,有限稀释法进行单克隆。通过观察EGFP的表达选定单克隆细胞株,再用流式细胞术分析、Real-time PCR和Western blot进行鉴定。结果:构建了PIRES2-mHlx-EGFP真核表达载体,并成功建立mHlx修饰和EGFP修饰的细胞系(dc2.4/mHlx和dc2.4/EGFP)。结论:成功建立稳定高表达mHlx的树突状细胞系dc2.4/mHlx,为深入探讨mHlx功能构建了平台,为Hlx修饰后的树突状细胞作为工具细胞的应用奠定了基础。

关键词： mHlx dc2.4 EGFP

青藤碱对dc2.4 JAK/STAT信号通路磷酸化的影响

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青藤碱对DC2.4 JAK/STAT信号通路磷酸化的影响

作者：晋小荣成都中医药大学

学位级别：硕士

目的1.对LPS刺激后的dc2.4成熟性进行鉴定,确保后续实验的科学性与可行性。2.青藤碱作用于成熟dc2.4后,观察细胞内SOCS1、JAK2、STAT1蛋白与基因含量变化及上清液中IFN-γ、IL-6、IL-10含量变化,探讨青藤碱对dc2.4细胞内JAK/STAT信号通... 详细信息

目的1.对LPS刺激后的dc2.4成熟性进行鉴定,确保后续实验的科学性与可行性。2.青藤碱作用于成熟dc2.4后,观察细胞内SOCS1、JAK2、STAT1蛋白与基因含量变化及上清液中IFN-γ、IL-6、IL-10含量变化,探讨青藤碱对dc2.4细胞内JAK/STAT信号通路的磷酸化作用机制,及其治疗类风湿关节炎机制,为治疗类风湿关节炎寻找新的治疗靶点。方法1.通过形态学及细胞膜上表型CD11C、CD80及CD86判定dc2.4成熟状态。2.将dc2.4细胞进行培养并分为A、B、C三组,A组为空白组,B组为模型组,C组为青藤碱组。A组不做处理,B组、C组分别经5μg/m L的LPS刺激培养24h,使dc2.4成熟,C组中继续加入40μg/mL的青藤碱,A组、B组不做进一步处理,继续培养三组细胞48h。Rt-PCR法检测三组细胞中SOCS1、JAK2、STAT1基因表达;Western Blot法检测各组细胞中SOCS1、JAK2、STAT1、p-JAK2、p-STAT1蛋白表达;取上清液,ELISA法检测炎症因子IFN-γ、IL-6、IL-10含量。结果***2.4成熟性鉴定(1)细胞形态学:dc2.4呈贴壁状态,为多角形、星形或梭形。加入LPS后,细胞状态改变不明显,仍为多角形、星形,且突起数目和长度较多。(2)表面标志物:通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,发现dc2.4经LPS作用24h后CD86的阳性百分率较未经LPS作用的空白组明显增加(Pdc2.4表面CD80平均荧光强度值较空白组明显增加(Pdc2.4经LPS作用24h与未经LPS作用相比,其两组细胞表面的分子CD11c的平均荧光强度值无差异(P>0.05),无统计学意义。2.青藤碱对dc2.4 JAK/STAT信号通路磷酸化作用(1)Rt-PCR检测三组dc2.4细胞中SOCS1、JAK2、STAT1 mRNA的表达与A组相比,B组dc2.4细胞内JAK2、STAT1明显增高(Pdc2.4细胞内p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1的表达量明显增高,SOCS1的表达量降低;与B组相比,C组dc2.4细胞中p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1表达降低,SOCS1的表达量显著增加。(3)ELISA法检测上清液中炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-10的表达与A组相比,B组dc2.4细胞内IFN-γ、IL-6含量明显降低(P2.4细胞为未成熟dc,经LPS作用后可转变为成熟dc。***/STAT通路中JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、SOCS含量变化受dc2.4细胞状态影响。3.青藤碱作用成熟dc2.4后,可以抑制JAK2/STAT1通路传导,其机制可能是青藤碱作用dc2.4后,活化细胞内的SOCS1,进而抑制JAK2和STAT1活化为蛋白p-JAK2、p-STAT1,从而抑制JAK2/STAT1通路磷酸化,阻碍信号转导。4.青藤碱作用成熟dc2.4后,可以抑制促炎因子INF-γ、IL-6分泌,促进抗炎因子IL-10分泌。5.青藤碱治疗RA作用机理可能是青藤碱作用成熟dc,激活其细胞内的SOCS1,从而抑制细胞内JAK2的磷酸化,进而阻断其底物STAT1的磷酸化,使p-JAK2与p-STAT1含量减低,抑制JAK2/STAT1信号通路,减少促炎因子INF-γ、IL-6释放,增加抗炎因子IL-10释放,同时抑制dc成熟,最终抑制炎症,达到治疗RA目的。

关键词：青藤碱 dc2.4 JAK2 STAT1 信号通路

自身免疫调节因子对dc2.4细胞表型及功能影响的研究

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自身免疫调节因子对DC2.4细胞表型及功能影响的研究

作者：牛坤伟吉林大学

学位级别：硕士

自身免疫调节因子（Autoimmune regulator，Aire）作为一种转录因子，其基因突变能够引发多器官自身免疫性疾病-APECED病。研究证实，中枢Aire通过调节mTECs上TRAs表达，清除自身反应性T细胞维持中枢免疫耐受。在外周，Aire主要表达在D... 详细信息

自身免疫调节因子（Autoimmune regulator，Aire）作为一种转录因子，其基因突变能够引发多器官自身免疫性疾病-APECED病。研究证实，中枢Aire通过调节mTECs上TRAs表达，清除自身反应性T细胞维持中枢免疫耐受。在外周，Aire主要表达在dc细胞上，不成熟dc能够诱导免疫耐受，也有报道称某些成熟dc也可参与诱导免疫耐受。此外，外周dc也能够表达TRAs诱导自身反应性T细胞清除或者诱导Treg的产生，维持耐受。但dc上表达的Aire功能和意义还不是很清楚，Aire是否也参与外周免疫耐受机制有待于探讨。基于以上背景，我们推测Aire可能通过影响dc细胞表型和成熟状态，以及调节TRAs表达而参与外周免疫耐受维持。为此，我们进行了以下几方面研究： 1.稳定转染Aire的dc2.4细胞的鉴定研究显示我们前期建立的稳定转染pEGFPC1/Aire（A1-1）、pEGFPC1（C1-1-1）质粒的dc2.4细胞株中Aire和GFP表达良好，可以用于后续实验。 2. Aire对dc2.4细胞表型的影响流式细胞术结果显示某些模式识别受体的配体处理后，A1-1组较C1-1-1组CD80、CD40、CD11c、CD83、CD86和MHC-II类分子表达降低。表明Aire能够使dc2.4维持不成熟状态。 3. Aire对dc2.4细胞增殖能力的影响细胞增殖-毒性检测测试各组细胞之间增殖能力无明显差异。表明Aire对dc2.4细胞增殖能力无影响。 4. Aire对dc2.4细胞吞噬能力的影响荧光微球吞噬实验结果显示，A1-1组较C1-1-1组细胞吞噬能力增强。表明Aire能够增强dc2.4吞噬功能，使其维持在不成熟状态。 5. Aire对dc2.4细胞TRAs表达的影响聚合酶链式反应结果显示，A1-1组细胞与C1-1-1组细胞相比，多种TRAs表达上调。提示Aire可能通过调节dc2.4上TRAs的表达参与外周耐受。本研究发现Aire可能通过影响dc细胞表型及其吞噬能力使其维持在不成熟状态，或者通过调控外周dc上TRAs的表达，参与外周免疫耐受的维持。这有利于揭示Aire在外周免疫系统表达的功能和意义，成为该领域的一创新点。

关键词： Aire dc2.4 TRAs 免疫耐受

氧化低密度脂蛋白对小鼠dc2.4细胞CD47及microRNA-155表达的影响

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氧化低密度脂蛋白对小鼠DC2.4细胞CD47及microRNA-155表达的影响

作者：张婷婷广州医学院

学位级别：硕士

目的观察氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）对小鼠树突状细胞株dc2.4细胞形态、表型成熟、膜蛋白CD47及microRNA-155表达的影响，初步探讨CD47和microRNA-155在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）条件下在dc成熟和迁移中的潜在作用。方法 1. dc2.4接种于6孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液培养至第3天，改用无血清培养基培养并分为2组，实验组加入ox-LDL（100ug/mL），对照组加入磷酸缓冲液（PBS）。使用光学显微镜观察细胞形态学变化;分别于干预后12小时、24小时收集dc2.4细胞，采用流式细胞仪检测细胞表型（MHC-II，CD80和CD86）的表达。 2. dc2.4接种于6孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液培养至第3天，用无血清培养基培养并分为2组，实验组加入ox-LDL（100ug/mL），对照组加入磷酸缓冲液（PBS）。分别于干预后12小时、24小时收集dc2.4细胞，分别提取蛋白后采用Western blot方法测定细胞表面CD47分子的表达;提取RNA后采用荧光定量PCR方法测定dc2.4细胞中microRNA-155的表达。结果 1.1dc2.4形态学观察：对照组细胞形态呈圆形或类圆形、较小、透亮，周边少量毛刺状或棘状突起;ox-LDL刺激12h及24h后观察细胞，发现细胞体积增大，胞浆逐渐丰富，呈不规则多型状态，具有典型的树突状突起。 1.2dc2.4成熟表型变化：收集实验组和对照组细胞进行流式细胞检测，经过ox-LDL处理后的dc2.4表型（MHC-II，CD80和CD86）的表达明显增加，与PBS对照组相比，存在统计学差异（P＜0.05）。 2.1经过ox-LDL处理后的dc2.4CD47的表达下降，与PBS对照组相比，存在统计学差异（P＜0.05）。 2.2经过ox-LDL处理后的dc2.4microRNA-155的表达增高，与PBS对照组相比，存在统计学差异（P＜0.05）。结论 ***-LDL可使dc2.4表面类分子MHC-II，CD80和CD86高表达，诱导dc2.4成熟。 2. ox-LDL可诱导dc2.4表面CD47分子下调表达、microRNA-155上调表达。

关键词：氧化低密度脂蛋白 dc2.4 CD47 microRNA-155

Foxp3,Galectin-9,PD-L1在小鼠dc2.4细胞的表达

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军医进修学院学报 2011年第1期32卷 75-77页

作者：宫玉波黄一飞韩根成李育蓉李新颖王大江杜改萍余继锋宋静解放军总医院眼科北京100853 军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室北京100850

目的观察CD80,CD86,Foxp3,Galectin-9,PD-L1在小鼠dc细胞的表达,了解小鼠dc2.4细胞系的免疫学特性。方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养小鼠dc2.4细胞,光学显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测CD80,CD86,Foxp3,Galectin-9,PD-L1在dc2.4细胞表达。结果光学显微镜示小鼠dc2.4细胞贴壁生长,呈树突、梭形及不规则形;流式细胞术检测dc2.4细胞CD80表达为91.04%±4.90%,CD86表达为98.54%±1.96%,Foxp3无或微表达,Galectin-9表达为14.33%±2.94%,PD-L1表达为98.80%±0.63%。结论小鼠dc2.4细胞是一个高表达CD80,CD86及PD-L1,低表达Galectin-9,无或微表达Foxp3的细胞系。

关键词： dc2.4 Foxp3 半乳糖凝集素-9 程序化死亡因子配体1