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TLR联合激活的dc瘤苗的抗肿瘤作用及其相关机制研究

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TLR联合激活的DC瘤苗的抗肿瘤作用及其相关机制研究

作者：叶燕浙江大学

学位级别：硕士

Toll样受体(toll-like receptor，TLRs)是一类主要表达在树突状细胞(dendritic cells，dc)、巨噬细胞等抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)上的跨膜蛋白，其识别病原体来源的产物，如TLR4识别革兰阴性菌的LPS;TLR3识别病毒感... 详细信息

Toll样受体(toll-like receptor，TLRs)是一类主要表达在树突状细胞(dendritic cells，dc)、巨噬细胞等抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)上的跨膜蛋白，其识别病原体来源的产物，如TLR4识别革兰阴性菌的LPS;TLR3识别病毒感染时产生的双链RNA，而TLR9识别原核染色体和DNA病毒中的未甲基化CpG DNA基序等。TLRs在宿主免疫系统对病原体的抵御过程中起着关键性的作用，可以说TLRs控制着APC对适应性免疫应答的激活。dc是体内功能最强的APC，也是唯一能活化初始T细胞(na(?)ve T cell)的APC，在特异性激活初始T细胞、联结天然免疫和获得性免疫应答中发挥独一无二的作用。dc的成熟在免疫应答中具有重要意义，是激活T细胞、启动免疫应答的必要条件。表达在dc上的TLRs能识别各种不同的微生物或病毒，与相应配体结合后能引起IL-6、IL-12等前炎症因子的分泌、共刺激分子的上调为特征的dc活化。TLRs介导的信号转导途径分为MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。当前的TLR信号模型学说认为MyD88是TLR2、5、7、8、9转导信号的唯一接头分子，而TLR3依赖TRIF-IRF3介导的途径在识别病原后产生IFN-β。TLR4的信号转导至少通过两条途径，其中，MyD88依赖途径是TLR4介导细胞因子分泌所必需的，而另外一条MyD88非依赖途径是它介导上调表达共刺激分子和MHC分子所必需的。近来研究发现不同TLRs的联合可以产生更为迅速持久的dc活化，并且倾向于诱导Th1型反应，而诱导机体产生抗原特异性的Th1型免疫应答是抗肿瘤免疫和抗感染免疫的关键点之一。此外，越来越多的研究认为TLRs和调节性T细胞有密切关联，后者能抑制dc成熟、T细胞分化和IL-2分泌，是启动适应性免疫应答的又一调控点，而在肿瘤部位的调节性T细胞也是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的机制之一。TLR配体介导的信号可以扭转调节性T细胞的抑制作用。因此，本实验以TLR配体(LPS、Poly I：C或CpG-ODN)单独或联合激活dc瘤苗，观察TLRs联合刺激对dc表型、功能等的影响，进而在体内用EG7肿瘤模型研究该种经TLR配体单独或协同刺激的dc瘤苗对肿瘤的抑制作用及其相关免疫学机制。目的观察用TLRs联合激活的dc瘤苗对C57BL/6小鼠EG7(用OVA转染的EL4)肿瘤模型的抑制作用并探讨其可能的机制，为抗肿瘤治疗新方法提供实验依据。方法 1．在体外用TLR配体单独或联合刺激dc：取6-8周龄C57BL/6小鼠，无菌分离股骨、胫骨，冲洗骨髓。将收集到的骨髓细胞破去红细胞后用dc培养基(mGM-CSF 10ng/ml，mIL-41ng/ml的完全培养基)孵箱培养，在培养的第2天小心弃去非黏附或疏松结合细胞，在培养的第6天用OVA刺激后分别用LPS、PolyI：C、CpG-ODN、LPS+PolyI：C、PolyI：C+CpG-ODN刺激，24h后收集细胞，得dcLPS、dcPolyI：C、dcCpG-ODN、dc(LPS+PolyI：C)、dc(PolyI：C+CpG-ODN)，然后检测各组dc表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ类分子(Ia)的表达，细胞上清中IL-6、IL-12p70、IL-23、INF-β的分泌水平以及各组dc刺激T细胞增殖能力的大小。 2．建立EG7肿瘤模型：C57BL/6小鼠品系，每组8只，共设7个组，分别为dcLPS组、dcPolyI：C组、dcCpG-ODN组、dc(LPS+PolyI：C)组、dc(PolyI：C+CpG-ODN)组和dc组，PBS为阴性对照组。各组中小鼠均右大腿外侧皮下接种EG7细胞，1×10cells/50μl/只。 3．用OVA作为抗原，观察各组dc瘤苗对EG7肿瘤的抑制作用：在肿瘤接种后第7天，用前面制备的dc瘤苗双侧腹股沟皮下注射(s．c．)治疗各组荷瘤小鼠，1×10cells/100μl/只，每侧注射50μl。末次治疗后第7天，随机取各组荷瘤小鼠脾细胞检测CD4CD25调节性T细胞比率并诱导细胞因子和CTL。然后用LDH释放法检测NK、CTL杀伤活性，用ELISA试剂盒检测Th1/Th2细胞因子并观察记录肿瘤生长情况以及各组小鼠存活期。 4．数据分析：数据用SPSS软件处理，二次方差分析，当P＜0.01时认为有统计学意义。结果 1．用TLR配体联合激活的dc无论在表型还是功能上都比单一配体刺激的dc具有更高的成熟度(P＜0.01)：TLRs联合尤其是TLR3和TLR9的联合在活化dc时在细胞因子(如IL-12p70、IL-23、IFN-β、IL-6)的分泌、共刺激分子(如CD40、CD80、CD86分

关键词：树突状细胞 Toll样受体联合激活 dc瘤苗 CD4+CD25+调性T细胞

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dc瘤苗制备及其在肿瘤免疫治疗中的应用

临床肿瘤学杂志 2004年第3期9卷 307-309,313页

作者：李曼陈宝安李翠萍东南大学附属中大医院血液科南京210009

树突状细胞(dc)是目前功能最强的抗原递呈细胞,能刺激初始型T细胞增殖,激发机体免疫应答.研究发现肿瘤患者体内dc数量明显减少,其表型及功能明显缺陷.近年来dc培养及dc瘤苗的研究取得较大进展,dc瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的新方法.

关键词： dc瘤苗制备肿瘤免疫治疗基因治疗

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dc瘤苗推动肿瘤免疫治疗

广州医学院学报 2009年第6期37卷 18-18页

解放军第309医院牛旗教授最近的研究成果：通过不同培育系统，体外诱导单核细胞成为树突状细胞（dc），并负载患者自身的肿瘤抗原，通过胸腔和腹腔注射等方式进入患者体内，激发特异性抗肿瘤免疫应答（T细胞免疫反应为主），清除肿瘤细... 详细信息

解放军第309医院牛旗教授最近的研究成果：通过不同培育系统，体外诱导单核细胞成为树突状细胞（dc），并负载患者自身的肿瘤抗原，通过胸腔和腹腔注射等方式进入患者体内，激发特异性抗肿瘤免疫应答（T细胞免疫反应为主），清除肿瘤细胞。这种携带着患者个体的特异肿瘤抗原信息的功能性dc就被称之为dc瘤苗。目前对dc瘤苗的研究已成为肿瘤免疫治疗领域的热点之一。

关键词：肿瘤免疫治疗 dc瘤苗特异性抗肿瘤免疫应答细胞免疫反应肿瘤抗原 309医院树突状细胞单核细胞

蒲公英甾醇联合dc肿瘤疫苗抑制NSCLC的作用及机制

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蒲公英甾醇联合DC肿瘤疫苗抑制NSCLC的作用及机制

作者：李冬玫遵义医科大学

学位级别：硕士

近年来研究显示,树突状细胞肿瘤疫苗(Dendritic cell tumor vaccine,dc-vac)在非小细胞肺癌(non-small cell lungs cancer,NSCLC)等恶性肿瘤临床干预中取得积极进展。然而,其干预效应有待提高,副作用仍待改善。蒲公英甾醇(taraxasterol,... 详细信息

近年来研究显示,树突状细胞肿瘤疫苗(Dendritic cell tumor vaccine,dc-vac)在非小细胞肺癌(non-small cell lungs cancer,NSCLC)等恶性肿瘤临床干预中取得积极进展。然而,其干预效应有待提高,副作用仍待改善。蒲公英甾醇(taraxasterol,Tara)是从蒲公英植株中提取的一种五环三萜类天然植物甾醇,具有抗炎、抗癌和抗氧化等多种药理活性。然而Tara是否能提高dc-vac治疗NSCLC疗效及改善其副作用尚未有研究探讨。本研究主要内容简述如下:目的:观察Tara联合dcs-vac治疗鼠源Lewis肺腺癌(Lewis lungs carcinoma,LLC)移植瘤的效果;整合网络药理学、RNA-seq及流式细胞术等技术,探讨联合治疗的分子机制,以期为后续开发dcs-vac联合中药天然成分干预NSCLC的临床新策略提供前期研究基础。方法:1.常规制备dcs-vac:提取6-10周龄的CD45.1C57BL/6小鼠骨髓原代细胞(Bone marrow-derived cells,BMCs),加入GM-CSF(40ng/ml)和IL-4(20ng/ml)诱导成骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMdcs);同时镜下观察细胞生长形态并拍照;通过流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)检测dc细胞诱导纯度,及dcs成熟情况;利用冻融法提取鼠源NSCLC细胞株LLC细胞(Lewis lungs carcinoma cells,LLCs)全抗原,荷载给dcs制备成抗LLCs的dcs-vac。2.观察Tara联合dcs-vac体内治疗小鼠NSCLC疗效:将LLCs(8×10/只)皮下注射C57BL/6野生型(wild type,WT)小鼠,建立小鼠NSCLC移植瘤模型;成瘤小鼠随机分为4组(n=5):PBS对照组,taraxasterol(Tara)组,dc瘤苗(dcs)组,Tara联合dc瘤苗(DT)组,分别以如下方法进行干预:PBS对照组:腹腔注射PBS(0.2ml/只),每3天一次,共注射6次;Tara组:腹腔注射Tara(10mg/kg),每3天注射一次,共干预6次;dcs组:尾静脉注射dcs-vac(1×10个/只),每7天注射1次,共干预3次;DT组:首次腹腔注射Tara(10mg/kg)12 h后尾静脉注射dcs-vac(1×10个/只),然后Tara每3天注射一次,共计干预6次,dcs-vac每7天注射1次,共计干预3次;监测并记录各组模型小鼠肿瘤生长情况,绘制生长曲线;在PBS组,Tara组,DT组小鼠末次干预后第3天,dcs组小鼠末次干预后第4天,麻醉处死各组小鼠,收集血清、肿瘤和主要脏器;H&E染色观察各组小鼠肿瘤与肺脏组织病理学变化。3.观察模型小鼠外周免疫器官CD4、CD8 T细胞的比例和功能变化:FCM法检测脾脏中CD4T、CD8T细胞比例及活化分子(CD62L、CD69)和细胞因子(IL-4、IFN-γ)的表达变化;并利用FCM检测模型小鼠肿瘤同侧的引流淋巴结(draining lymph nodes,DLN)中CD4T、CD8T细胞增殖抗原Ki-67和活化分子CD69的表达变化。4.观察模型小鼠肿瘤局部CD4、CD8 T细胞浸润和功能变化:利用免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)观察各组小鼠肿瘤局部免疫细胞CD4T,CD8T细胞的浸润情况,及CD8T细胞表达IFN-γ情况。5.观察Tara对dcs-vac成熟及肿瘤局部浸润的影响:在体外通过CCK-8实验检测Tara对dcs-vac细胞活性影响;利用FCM检测Tara对dcs-vac细胞膜分子MHCII,CD80,CD86表达的影响;IF观察各组小鼠肿瘤局部dcs浸润的情况。6.观察Tara对肿瘤细胞凋亡的影响:TUNEL法检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况;AV-PI双染法分析LLCs体外凋亡情况。7.观察细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)对肿瘤细胞的杀伤作用:将瘤细胞全抗原(200μg/只)皮下注射6周龄C57BL/6 WT小鼠,每7天免疫1次,共3次;末次免疫后第7天麻醉处死小鼠,解剖脾脏并制成单细胞悬液,利用免疫磁珠分选技术(Magnet-Activated Cell Sorting,MACS)分选脾CD8T淋巴细胞;按不同效应细胞:靶细胞比例共培养CD8T细胞和LLCs,然后利用FCM检测LLCs凋亡率;并利用IF观察各模型肿瘤组织中CD8T细胞和凋亡细胞的共定位情况。选取各组小鼠肿瘤组织,进行转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq),分析各组肿瘤

关键词：非小细胞肺癌蒲公英甾醇 dc瘤苗 Ⅰ型胶原蛋白 PIK3R1

肝癌细胞裂解物致敏的树突状细胞瘤苗预防肝癌术后转移复发

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中华肝脏病杂志 2005年第6期13卷 432-435页

作者：高建陈敏任红重庆医科大学病毒性肝炎研究所教育部感染性疾病分子生物学重点实验室400010

目的探讨人自体肝癌细胞裂解物致敏的树突状细胞(D C)瘤苗预防肝癌术后转移复发的价值。方法从肝癌患者外周血单核细胞中诱导D C,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)刺激活化,经自体肝癌细胞... 详细信息

目的探讨人自体肝癌细胞裂解物致敏的树突状细胞(D C)瘤苗预防肝癌术后转移复发的价值。方法从肝癌患者外周血单核细胞中诱导D C,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)刺激活化,经自体肝癌细胞裂解物致敏D C制备瘤苗。将3 0例肝癌术后患者随机分为D C瘤苗治疗组1 5例,对照组1 5例。对两组病例治疗前后免疫功能、临床疗效、肿瘤转移复发率及生存率进行观察比较。结果dc瘤苗治疗后外周血CD 3+、CD4+/CD 8+及自然杀伤细胞比率较治疗前明显升高(Pdc瘤苗治疗后血清IL-1 0水平明显下降(Pdc瘤苗治疗组的转移复发率为13.3 3%,明显低于对照组53.33%(P dc瘤苗治疗,可改善患者的免疫功能,降低肿瘤转移复发率,提高患者术后生存率,为肝癌的免疫治疗开辟一条新途径。

关键词：细胞裂解物致敏转移复发树突状细胞瘤苗重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子预防重组人白细胞介素外周血单核细胞血清IL-10 dc瘤苗自然杀伤细胞免疫功能肿瘤转移 CD^8+ 术后生存率对照组治疗组复发率治疗后

树突状细胞介导的T细胞抗多发性骨髓瘤细胞活性的研究

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中华内科杂志 2007年第4期46卷 312-314页

作者：丁岩松陈文明首都医科大学附属北京朝阳医院血液内科 100020

多发性骨髓瘤（MM）是B细胞来源的恶性肿瘤。化疗和造血干细胞移植等综合治疗，可获得较高的缓解率，但微小残留病的存在，使骨髓瘤易复发。树突状细胞（dc）为基础的免疫治疗是近几年来治疗MM的热点之一。国外报道用凋亡的骨髓瘤细胞... 详细信息

多发性骨髓瘤（MM）是B细胞来源的恶性肿瘤。化疗和造血干细胞移植等综合治疗，可获得较高的缓解率，但微小残留病的存在，使骨髓瘤易复发。树突状细胞（dc）为基础的免疫治疗是近几年来治疗MM的热点之一。国外报道用凋亡的骨髓瘤细胞或分泌的异常单克隆Ig，即M蛋白脉冲dc，得到dc瘤苗，再回输体内，可以观察到骨髓瘤特异的抗瘤效应。本实验体外诱导培养dc，负载骨髓瘤细胞全抗原或分泌的M蛋白，探讨负载抗原的dc对淋巴细胞的活化作用及活化的淋巴细胞对自体、异体骨髓瘤细胞的杀伤活性。

关键词：多发性骨髓瘤树突状细胞介导细胞活性 T细胞骨髓瘤细胞造血干细胞移植 dc瘤苗体外诱导培养

白细胞介素-18修饰的树突状细胞瘤苗的制备及其抗肿瘤免疫保护作用的研究

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浙江临床医学 2006年第1期8卷 5-6页

作者：王峻何炳荣孙宏高邵传森沈建根杭州市红十字会医院 310003 浙江大学免疫学研究所 310031

目的研究树突状细胞(dc)瘤苗的抗肿瘤免疫保护治疗作用,进一步探索dc为基础的肿瘤免疫治疗的新途径。方法以腺病毒为载体转染IL-18和/或gp100-dc,制备dc瘤苗,以ELISA、RT-PCR、FACS及混合淋巴细胞反应(MLR)检测所制备的dc瘤苗的效果,以... 详细信息

目的研究树突状细胞(dc)瘤苗的抗肿瘤免疫保护治疗作用,进一步探索dc为基础的肿瘤免疫治疗的新途径。方法以腺病毒为载体转染IL-18和/或gp100-dc,制备dc瘤苗,以ELISA、RT-PCR、FACS及混合淋巴细胞反应(MLR)检测所制备的dc瘤苗的效果,以黑色素肿瘤动物模型鉴定dc瘤苗的抗肿瘤免疫保护作用。结果本研究成功制备了dc瘤苗,IL-18/gp100-dc的抗肿瘤免疫保护作用明显强于IL-18-dc或gp100-dc瘤苗。结论Th1型细胞因子IL-18和gp100共转染能显著增强dc的抗肿瘤作用。

关键词：树突状细胞瘤苗免疫保护作用抗肿瘤免疫白细胞介素-18 制备混合淋巴细胞反应 Th1型细胞因子 IL-18 dc瘤苗

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树突状细胞与肿瘤免疫治疗

中华国际医学杂志 2001年第5期1卷 444-445页

作者：李胜李占元山东省肿瘤防治研究院，中国济南250117 山东大学齐鲁医院

树突状细胞(dendritic cells, dc) 广泛分布于除脑以外的全身各脏器,是已知体内抗原提呈功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),能摄取各类抗原,表达主要组织抗原复合物(major histocompatiblity complex,MHC)分子、共... 详细信息

树突状细胞(dendritic cells, dc) 广泛分布于除脑以外的全身各脏器,是已知体内抗原提呈功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),能摄取各类抗原,表达主要组织抗原复合物(major histocompatiblity complex,MHC)分子、共刺激分子、粘附分子及高水平辅助T细胞(help T cell 1,Th1)型应答主导因子-IL-12,体内、外均能激发T细胞增殖,诱导特异性T细胞介导细胞毒性作用(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的生成[1].近年来,开展dc作为免疫细胞治疗肿瘤的研究甚为活跃.

关键词：树突状细胞肿瘤免疫治疗 dc瘤苗