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A-PRF与dbbm及dbbm collagen单独/联合使用对骨再生影响的实验研究

A-PRF与DBBM及DBBM Collagen单独/联合使用对骨再生影响的实验研究

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作者：赵瑞敏兰州大学

学位级别：硕士

目的:dbbm（Demineralized bovine bone minerals）和dbbm collagen是口腔骨缺损再生中常用的骨替代材料,具有良好的骨引导性,但缺乏骨诱导性;A-PRF是来自血液的生物材料,富含血小板与生长因子,可促进组织愈合修复。本研究通过体内外实... 详细信息

目的:dbbm（Demineralized bovine bone minerals）和dbbm collagen是口腔骨缺损再生中常用的骨替代材料,具有良好的骨引导性,但缺乏骨诱导性;A-PRF是来自血液的生物材料,富含血小板与生长因子,可促进组织愈合修复。本研究通过体内外实验,探究在A-PRF与dbbm及dbbm collagen单独或联合使用时对兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）生物学行为和牙槽窝愈合过程中骨形成的影响。材料和方法:从兔四肢长骨中获取骨髓,全骨髓贴壁法分离兔原代BMSCs,流式细胞仪检测表面标志物,茜素红和油红O染色检测多向分化情况;收集兔静脉血以1300r/min转速离心14min制备A-PRF。体外实验:将APRF浸泡于完全培养基中制备10%的A-PRF条件培养基;通过扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）和激光共聚焦显微镜观察A-PRF对BMSCs在dbbm和dbbm collagen上的黏附情况,CCK8法检测BMSCs在对照组,A-PRF组、dbbm组、dbbm collagen组、dbbm+A-PRF组和dbbm collagen+A-PRF组中的增殖情况;使用AKP定量检测和q PCR检测对照组和各实验组RUNX2、Osx和OPN的基因表达情况。体内实验:拔除兔下颌双侧中切牙建立缺牙模型,在拔牙窝中分别填充A-PRF、dbbm、dbbm collagen、dbbm与A-PRF的混合物和dbbm collagen与A-PRF的混合物,2、4、8周后从G1、G2和G3中各随机选择3只处死获取下颌骨,通过甲苯胺蓝染色观察牙槽窝愈合和骨形成情况,免疫组织化学染色对比各拔牙窝中成骨细胞RUNX2和OCN的表达情况。结果:体外实验:原代BMSCS形态稳定,状态良好,漩涡状生长;流式检测:CD29和CD44的阳性表达率为95.69%和99.92%,而CD45阳性表达率为3.96%、CD34为0.08%;成脂、成骨条件下培养21天后油红O和茜素红染色阳性;SEM观察dbbm+A-PRF和dbbm collagen+A-PRF组中的细胞形态铺展,后者可观察到细胞的迁移现象;激光共聚焦显微镜显示dbbm collagen与A-PRF联合使用时细胞黏附数量最多;CCK8结果显示A-PRF单独应用可促进细胞增殖,与材料同时应用时亦可促进细胞的增殖活性;AKP活性检测证明在成骨诱导条件下,A-PRF单独应用可促进BMSCs成骨分化,但与dbbm和dbbm collagen联合应用无明显差异。q PCR结果表明A-PRF可增强RUNX2和Osx基因表达;除dbbm和dbbm+A-PRF的RUNX2表达无差异外,加入A-PRF可促进Osx、OCN在dbbm和dbbm collagen中和RUNX2在dbbm collagen中的表达。体内实验:可通过兔下颌中切牙建立稳定的缺牙模型;组织学观察A-PRF可以促进牙槽骨愈合早期（2W）时的新骨形成,A-PRF与dbbm和dbbm collagen联合使用可促进材料的骨结合能力;dbbm collagen相较于dbbm在8周时与新生骨的接触更多。免疫组化染色结果显示A-PRF对骨形成的影响主要表现在2周时,RUNX2和OCN的表达量在A-PRF组中高于对照组,与单独用用dbbm和dbbm collagen相比,A-PRF的加入提高了成骨细胞OCN的表达量。结论:A-PRF可促进细胞增殖黏附和成骨分化,这一影响在与dbbm和dbbm collagen联合使用时仍可观察到,提高了材料的生物相容性。2周时APRF可促进牙槽窝愈合中的骨形成和材料的骨结合;与dbbm相比,dbbm collagen在8周时表现出更好的骨结合能力。

关键词： A-PRF 骨再生 dbbm 骨髓间充质干细胞 dbbm collagen

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