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d1蛋白酶的高效毛细管电泳检测

华中师范大学学报（自然科学版） 2010年第3期44卷 455-459,462页

作者：张艳梅陈腊月李伟国郭建军刘中来姚汉超刘艳丽祁超华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室 430079 华中师范大学化学学院武汉430079

在低温条件下表达的两种融合蛋白pET-28a ctpA与pET-23a-ctpA通过亲和色谱纯化、层析柱脱盐及浓缩,获得大量较高纯度的可溶性融合蛋白;并用高效毛细管电泳(HPCE)技术对两种融合蛋白进行分离检测,同时用荧光法配合确证.高效毛细管电泳分... 详细信息

在低温条件下表达的两种融合蛋白pET-28a ctpA与pET-23a-ctpA通过亲和色谱纯化、层析柱脱盐及浓缩,获得大量较高纯度的可溶性融合蛋白;并用高效毛细管电泳(HPCE)技术对两种融合蛋白进行分离检测,同时用荧光法配合确证.高效毛细管电泳分离检测结果显示,运行缓冲液的pH值相同时,两种融合蛋白的迁移时间存在显著差异;运行缓冲液的pH值在一定范围内变化时,同种蛋白的迁移时间无显著变化,表明蛋白结构是影响蛋白迁移的主要因素,两种蛋白的结构存在差异.

关键词： d1蛋白酶融合蛋白高效毛细管电泳

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d1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及抗体的制备

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D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及抗体的制备

作者：李慧华中师范大学

学位级别：硕士

d1蛋白酶(d1 C-terminal processing protease, CtpA)是由叶绿体核ctpA基因编码,主要用于酶切d1蛋白前体羧基端延伸的肽段,使d1蛋白前体转变为成熟的d1蛋白,从而用于光合系统Ⅱ中锰簇合物的组装,具有维持光合系统Ⅱ损伤-修复循环过程的... 详细信息

d1蛋白酶(d1 C-terminal processing protease, CtpA)是由叶绿体核ctpA基因编码,主要用于酶切d1蛋白前体羧基端延伸的肽段,使d1蛋白前体转变为成熟的d1蛋白,从而用于光合系统Ⅱ中锰簇合物的组装,具有维持光合系统Ⅱ损伤-修复循环过程的重要作用,该酶切过程是植物进行光合作用必不可少的步骤。因此,d1蛋白酶被认为是一个新型优异的广谱除草剂作用靶标。为了开发以d1蛋白酶作为靶标的新型除草剂,需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。由于该蛋白在天然蛋白中的含量较低,所能提取得到的酶蛋白总量也有限,因此采用基因工程的方法可获得稳定来源的酶蛋白,以供大规模的筛选所需。本文通过基因工程方法,选用大肠杆菌原核表达系统表达菠菜CtpA蛋白。从菠菜中提取总RNA,逆转录合成cdNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增了CtpA的基因,分别连接至表达载体pET-23a和pET-28a中,并在大肠杆菌BL21(dE3)中进行高效表达。结果表明重组质粒pET-23a-CtpA在0.2 mmol/L IPTG,8℃诱导培养72小时条件下,重组质粒pET-28a-CtpA在0.1 mmol/L IPTG,8℃诱导培养72小时条件下,重组蛋白均可获得高效表达。分别采用Ni-NTA亲和层析法对重组蛋白进行了纯化,SdS-PAGE和Western blotting印迹结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的d1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱法测定了其水解活性,结果表明活性可达1.10 nmol/(mg·min),为文献报道数据的15倍。采用纯化后的CtpA蛋白免疫日本长耳大白兔制备了多克隆抗体、免疫Balb/c雌鼠制备了单克隆抗体,ELISA法测定二者血清抗体的效价均高达1：100000,共得到4株单克隆抗体细胞株。所得结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。

关键词： d1蛋白酶表达纯化活性测定抗体

d1蛋白酶的分离纯化及其与抑制剂先导化合物的相互作用

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D1蛋白酶的分离纯化及其与抑制剂先导化合物的相互作用

作者：黎江华中师范大学

学位级别：硕士

药物发现是药物研发的初始阶段,是人们寻找和认识物质药用价值的实践过程。药物发现包括药物分子的设计、合成、药物靶标的发现与确认、先导化合物的筛选和优化等过程。农药发现具有相似的过程,其中新型靶标的发现以及基于新型靶标的创... 详细信息

药物发现是药物研发的初始阶段,是人们寻找和认识物质药用价值的实践过程。药物发现包括药物分子的设计、合成、药物靶标的发现与确认、先导化合物的筛选和优化等过程。农药发现具有相似的过程,其中新型靶标的发现以及基于新型靶标的创新农药发现在现代农药发展过程中具有重要地位。 d1蛋白是光合作用系统Ⅱ核心复合体的重要组成部分,由d1蛋白前体通过d1蛋白酶(carboxyterminal processing protease of d1 protein,CtpA)的酶切作用转化而来,在此过程中,d1蛋白酶主要剪切d1蛋白前体羧基端延伸肽段,将d1蛋白前体转化为成熟d1蛋白。由于当前广泛使用的除草剂作用靶标是d1蛋白,而d1蛋白酶在植物体内的含量只有d1蛋白的1%,因而d1蛋白酶被认为是一个新型高效的除草剂作用靶标。提取纯化d1蛋白酶,并建立基于d1蛋白酶靶标的新型抑制剂生物活性的筛选方法,对于发现d1蛋白酶抑制剂先导化合物及其结构优化具有重要意义。本论文工作主要包括三方面的研究内容:1)d1蛋白酶的提取纯化;2)d1蛋白酶比活力和米氏常数K的测定;3)基于d1蛋白酶靶标的抑制剂先导化合物生物活性研究。 1).分离纯化d1蛋白酶以新鲜菠菜为原料,经过研磨、匀浆,缓冲液溶解等步骤提取叶绿体,采用超声波破碎和缓冲液溶解获得内囊体膜总蛋白,通过硫酸铵盐析沉淀得到粗蛋白酶。粗蛋白酶经过阴离子交换和凝胶过滤柱层析进行进一步提纯,获得纯度达到90%的d1蛋白酶。 2).d1蛋白酶比活力和米氏常数K的测定以合成的d1蛋白前体羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱分析d1蛋白酶催化模拟底物的水解反应,跟踪检测了d1蛋白酶分离提纯过程各步骤获得的d1蛋白比活力,最大比活力达到0.172 nmol·mg·min;测定了d1蛋白酶对模拟底物24肽的米氏常数K为19.6μM。 3).基于d1蛋白酶靶标的抑制剂先导化合物生物活性研究。以菠菜d1蛋白前体的羧基端24肽为模拟底物,以高效液相色谱(HPLC)为分析手段,测定了部分d1蛋白酶抑制剂先导结构化合物的生物活性,建立了基于d1蛋白酶靶标的新型抑制剂先导化合物生物活性研究平台。采用的部分d1蛋白酶抑制剂先导结构化合物的分子结构如下所示: 上图中的四个d1蛋白酶抑制剂先导化合物由本实验室通过同源模建、虚拟筛选以及化学合成得到。基于靶标酶的生物活性测试表明,这四个化合物a1、a2、b1、b2对d1蛋白酶催化活性具有明显的抑制作用。这些化合物对d1蛋白酶的抑制作用属于竞争性抑制,抑制常数分别为3.8,4.9,5.2,8.8μM。对照这些化合物的除草活性数据,可以得知,具有较低抑制常数的化合物如a1和a2,在100 ppm时,其对双子叶植物油菜生长的抑制率均达到100%。因此,本研究工作建立了一个以酶学反应和HPLC检测的d1蛋白酶靶标验证和d1蛋白酶抑制剂筛选的方法。

关键词： d1蛋白酶分离提纯比活力米氏常数抑制剂抑制常数

毛细管区带电泳测定d1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选

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分析化学 2011年第11期39卷 1758-1761页

作者：陈腊月李伟国黄雪英刘中来刘艳丽冯璐廖宏珊熊国梅祁超华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室华中师范大学化学学院农药与化学生物学教育部重点实验室

建立了毛细管区带电泳技术快速测定d1蛋白酶活性及其抑制剂先导化合物的筛选方法。实验选用未涂层熔融石英毛细管(43 cm 5mm)和磷酸盐缓冲溶液(50 mmol/L, pH 3.0)作为分离介质,运行电压18 kV,测定了d1蛋白酶的活性并对部分抑制剂先导... 详细信息

建立了毛细管区带电泳技术快速测定d1蛋白酶活性及其抑制剂先导化合物的筛选方法。实验选用未涂层熔融石英毛细管(43 cm 5mm)和磷酸盐缓冲溶液(50 mmol/L, pH 3.0)作为分离介质,运行电压18 kV,测定了d1蛋白酶的活性并对部分抑制剂先导化合物进行了筛选。结果表明, ITP26和ITP21两种异噁唑噻唑哌啶类先导化合物对蛋白酶活性具有抑制作用,抑制率分别为26%和13%。

关键词： d1蛋白酶毛细管区带电泳活性先导化合物

毛细管区带电泳测定d1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选

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毛细管区带电泳测定D1蛋白酶的活性及其抑制剂先导化合物的筛选

作者：陈腊月华中师范大学

学位级别：硕士

d1蛋白是植物PSII中不可缺失的亚基组成部分,它是Mn4Ca簇(水氧化的催化中心)中锰原子的配体。d1蛋白酶(d1 C-terminal processing protease, CtpA)是由叶绿体核ctpA基因编码、含有389个氨基酸残基的单亚基蛋白,分子量大小约为45kda,广... 详细信息

d1蛋白是植物PSII中不可缺失的亚基组成部分,它是Mn4Ca簇(水氧化的催化中心)中锰原子的配体。d1蛋白酶(d1 C-terminal processing protease, CtpA)是由叶绿体核ctpA基因编码、含有389个氨基酸残基的单亚基蛋白,分子量大小约为45kda,广泛存在于各种植物体中。其主要作用是剪切d1蛋白前体C端延伸的肽段,促使其转化成具有生物活性的d1蛋白,用于PSII中锰簇复合物的组装,该酶切过程成为植物进行光合作用所必须的步骤。由于dI蛋白酶在植物体中的含量只有d1蛋白的1%,因此被认为是一种新型优异的广谱除草剂作用靶标。建立d1蛋白酶靶标生物活性的测定及其抑制剂先导化合物的筛选方法,对开发d1蛋白酶抑制剂及其分子结构的优化具有重要的意义。本文根据d1蛋白酶抑制剂先导化合物开发和筛选的实际需要,采用毛细管区带电泳技术研究了酶蛋白活性检测及其先导化合物筛选的方法。分别对分离缓冲液pH值、浓度、温度、毛细管柱有效长度等影响因素进行了优化,选用43 cm×75μm (id)未涂层熔融石英毛细管和磷酸盐缓冲溶液(50 mM, pH 3.0)作为分离介质,运行电压18 kV,测定了d1蛋白酶的生物活性并对部分抑制剂先导化合物进行了筛选。结果表明ITP26、ITP21两种异嗯唑噻唑哌啶类先导化合物对蛋白酶表现出不同程度的抑制作用,抑制率分别为26%和13%。

关键词： d1蛋白酶毛细管区带电泳先导化合物活性

Nε-苯胺酰基-Nα-（3-取代苯基异噁唑-5-基羰基）赖氨酸类化合物的合成及其除草活性研究

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有机化学 2010年第9期30卷 1366-1371页

作者：胡德金刘素芳黄统辉涂海洋李伟国朱晓磊张爱东华中师范大学化学学院农药与化学生物学教育部重点实验室武汉4300791

植物细胞内囊体中的d1蛋白酶是近年来发现的潜在的除草剂作用靶标.以异噁唑甲酰赖氨酸脲先导结构信息为基础,设计合成了未见报道的异噁唑甲酰赖氨酸类化合物11个.目标化合物分子结构经IR,1HNMR,元素分析予以确证.平皿法活体生物活性测... 详细信息

植物细胞内囊体中的d1蛋白酶是近年来发现的潜在的除草剂作用靶标.以异噁唑甲酰赖氨酸脲先导结构信息为基础,设计合成了未见报道的异噁唑甲酰赖氨酸类化合物11个.目标化合物分子结构经IR,1HNMR,元素分析予以确证.平皿法活体生物活性测试表明部分化合物具有中等除草活性;化合物8h的离体生物活性测试表明其对d1蛋白酶有一定的抑制作用.

关键词： d1蛋白酶抑制剂异噁唑酰赖氨酸合成除草剂

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5-（烷基氨基）乙内酰脲衍生物的合成及生物活性研究

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5-（烷基氨基）乙内酰脲衍生物的合成及生物活性研究

作者：黄刚华中师范大学

学位级别：硕士

自19世纪在人体的尿囊中发现了乙内酰脲以来，乙内酰脲及其各种衍生物所具有的生物活性引起了人们的广泛关注。自1985年Trigo和Lopez发表了关于乙内酰脲化学的综述文章以来，乙内酰脲衍生物化学及其生物活性又有了很多新的发现，并且乙... 详细信息

自19世纪在人体的尿囊中发现了乙内酰脲以来，乙内酰脲及其各种衍生物所具有的生物活性引起了人们的广泛关注。自1985年Trigo和Lopez发表了关于乙内酰脲化学的综述文章以来，乙内酰脲衍生物化学及其生物活性又有了很多新的发现，并且乙内酰脲的衍生物作为药物的治疗作用在临床上也得到了更进一步的应用。乙内酰脲传统的应用包括：苯基乙内酰脲作为抗癫痫的药物，azimilide作为抗心律失常的药物，呋喃妥英作为抗菌的药物和作为肌肉放松的药物等。新的乙内酰脲药物在治疗其它疾病方面也得到了很大的发展，例如，非甾类化合物尼鲁米特(nilutamide)，作为抗雄激素物质用于治疗亚稳定状态的前列腺癌在1996年通过了FdA的认证并得到了临床应用。乙内酰脲的合成研究一直是药物研究关注的焦点，各种新的合成方法和新的乙内酰脲衍生物相继出现。我们通过对处于植物光合作用中心PSⅡ中d1蛋白酶的同源模建和虚拟筛选，得到一类5位上连接氮原子的乙内酰脲先导化合物，而这类化合物到目前还未见文献报道，因此，通过合理设计与合成这类5位氨基的乙内酰脲衍生物，有可能获得新型高效的除草剂新品种。 d1蛋白酶是植物光合作用链中不可缺少的，处于植物光合系统Ⅱ的d1蛋白酶被认为是一个优异的广谱除草剂的作用靶标[1]，由于d1蛋白酶在植物中分布量只有d1蛋白的1％左右，与当前广泛使用的抑制d1蛋白的除草剂(如西玛津、阿特拉津、敌草隆等)相比，可以预计d1蛋白酶抑制剂将是一种更为高效的新型除草剂。本文在对d1蛋白酶的同源模建和虚拟筛选基础上，设计合成了一类5-(烷基氨基)乙内酰脲先导化合物，并且进行生物活性研究。本文的主要工作是合成了5-(烷基氨基)乙内酰脲，并且在这类新化合物的基础上经过进一步的衍生化，得到一系列的新的乙内酰脲衍生物，进行活体的生物活性测定，对部分化合物与d1蛋白酶相互作用进行了SPR分析。主要内容如下： 1．以2，4，5-咪唑啉三酮为中间体，合成了三种未见文献报道的5-(烷基氨基)乙内酰脲，其分子结构经过NMR，MS，IR等进行了确认;2．通过对合成的5-(烷基氨基)乙内酰脲环外氨基进行取代得到了如下图所示的第Ⅰ类衍生物;再对合成的和5-(烷基氨基)乙内酰脲环外氨基和环上3位的氨基同时取代得到了如下图所示的第Ⅱ类衍生物。此两类新的乙内酰脲衍生物的分子结构经过NMR，MS，IR等进行了确认;3．对合成的目标化合物进行了生物活性检测，发现大多数目标化合物在100ppm时对油菜类的双子叶植物有很好的生长抑制作用，抑制率都在80％以上，其中第Ⅱ类化合物对于油菜类的双子叶植物的抑制率都在90％以上。 4．采用表面等离子共振技术(SPR)，对含有双硫键的目标化合物与菠菜d1蛋白酶的相互作用进行了研究。实验结果表明，此化合物和菠菜d1蛋白酶有明显的相互作用，结合常数k=3.94×10MS，亲和常数K=5.59×10M，证明了这类化合物对处于光合作用中心的d1蛋白酶有抑制作用。

关键词：乙内酰脲 2,4,5-咪唑啉三酮表面等离子共振(SPR) d1蛋白酶抑制剂

核磁共振技术在有机化合物和多肽分子结构和功能研究中的应用

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核磁共振技术在有机化合物和多肽分子结构和功能研究中的应用

作者：夏顺霞华中师范大学

学位级别：硕士

本论文主要工作是应用液体高分辨核磁共振技术对一类特别的有机化合物及两种多肽分子结构与功能进行了分析.其次也对固态核磁共振技术研究抗菌肽的抗菌机理的方法进行了一些初步探索.论文的内容编排如下: 1.对多维NMR在有机小分子和多... 详细信息

本论文主要工作是应用液体高分辨核磁共振技术对一类特别的有机化合物及两种多肽分子结构与功能进行了分析.其次也对固态核磁共振技术研究抗菌肽的抗菌机理的方法进行了一些初步探索.论文的内容编排如下: 1.对多维NMR在有机小分子和多肽分子结构及功能研究中的方法和应用方面进行了简要概述(第一章),尤其对液体和固态核磁共振技术研究抗菌肽结构和抗菌机理的方法进行了综述,其中又以固态核磁共振技术这一新的方法为重点介绍对象(第四章). 2.综合运用液体高分辨NMR常规的一维H NMR、C NMR、dEPT、T,以及二维gCOSY、gHSQC、gHMBC实验对三个取代四氢苯并[4’,5’]噻吩并[3’,2’:5,6]吡啶并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮化合物的衍生物H和C NMR信号进行解析,为研究毗啶并嘧啶类化合物良好的生物活性机理提供了重要的参考依据(第二章). 3.运用液体高分辨NMR对菠菜光合系统Ⅱ(PSⅡ)中d1蛋白酶和d1蛋白前体(pd1)的酶切反应机理进行了研究.S24多肽是按照菠菜细胞类囊膜上的d1蛋白前体羧端的24个氨基酸序列合成的多肽,它可以代替d1蛋白前体(d1)作为d1蛋白酶的作用底物.本实验主要是采用TOCSY和NOESY谱图对S24多肽在水溶液中的结构进行了研究,并从结构出发来推测其反应的机理,首先是对S24多肽的主链进行了顺序归属,其次根据化学位移标识(CSI)和短～中等范围H-H的NOE并结合圆二色性(Cd)实验来确定二级结构单元,结果显示S24多肽在水溶液中呈现无规卷曲结构,推测S24多肽是在与蛋白酶相互作用的过程中形成部分结构的(第三章).

关键词：核磁共振NMR 多维核磁共振谱吡啶并嘧啶类化合物 PS II光合系统 pd1 d1蛋白酶圆二色性抗菌肽固体NMR

具有生物活性的噁唑并嘧啶酮及双酰肼类化合物的合成与性质

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具有生物活性的噁唑并嘧啶酮及双酰肼类化合物的合成与性质

作者：蔡昌权华中师范大学

学位级别：硕士

噁唑并嘧啶(酮)类化合物具有独特的药理活性,已成为药物开发的热点。d1蛋白酶是新的广谱除草剂的作用靶标,开发以d1蛋白酶为靶标的除草剂具有特别重要的意义。本论文研究了运用氮杂Wittig反应来合成噁唑并嘧啶类杂环化合物,并探索了反... 详细信息

噁唑并嘧啶(酮)类化合物具有独特的药理活性,已成为药物开发的热点。d1蛋白酶是新的广谱除草剂的作用靶标,开发以d1蛋白酶为靶标的除草剂具有特别重要的意义。本论文研究了运用氮杂Wittig反应来合成噁唑并嘧啶类杂环化合物,并探索了反应条件及规律。论文还研究了虚拟筛选得到的d1蛋白酶抑制剂的合成及除草活性。所有合成化合物都经红外光谱、核磁共振光谱、质谱、元素分析进行结构表征和确认。具体研究内容如下:1、通过研究原料配比及有氧存在对产物纯度的影响,以优化的反应条件制取了膦亚胺4。结果表明:在氮气保护下,以大约等当量的原料配比制得的膦亚胺纯度较高。2、利用膦亚胺4先后与异氰酸酯及亲核试剂反应,得到31个未见文献报道的噁唑并[5,4-d]嘧啶-7(6H)-酮衍生物。探讨了在不破坏噁唑环的情况下碳二亚胺5与亲核试剂加成反应的规律,结果表明:氮亲核试剂(伯胺和仲胺)与碳二亚胺5作用后,以醇钠作催化剂,须隔绝氧气才能顺利关环;而酚与碳二亚胺5反应在固体碳酸钾催化下,加热到40～50℃即可顺利关环;醇与碳二亚胺5在上述情况下则未得到预期化合物。3、应用氮杂Wittig反应合成了12个未见文献报道的噁唑并[5,4-d]-1,2,4-三唑并[1,5-a]嘧啶-9(3H)-酮衍生物,丰富了氮杂Wittig反应在有机合成中的应用,为该类稠杂环的合成提供了一个简捷有效的新方法。4、以计算机虚拟筛选的先导化合物结构为基础,设计合成了两个系列共14个双酰肼类化合物,探讨了反应条件,对氨基上的双酰化及单酰化的选择性进行了合理的解释。5、对合成的部分化合物的杀菌活性和除草活性进行了测试。结果表明:部分噁唑并[5,4-d]嘧啶-7(6H)-酮化合物对水稻纹枯菌、小麦赤霉菌、黄瓜灰霉菌、苹果轮纹菌、棉花枯萎菌、棉花炭疽表现出一定的抑菌活性,有的还达到80%～96%,如8e、8i和8n在浓度为100ppm时对黄瓜灰霉菌分别有92%、83%和96%的抑制率。化合物16和18有好的除草活性,在浓度为100ppm时,大部分化合物对双子叶植物和单子叶植物的根和茎的抑制率达到80%-99%,如16a、16c、18b、18f、18h、18i对双子叶植物的根的抑制达到A级,16b、18b、18c、18f、18g、18h、18i、18k对单子叶植物的根的抑制达到A级。

关键词：噁唑并嘧啶衍生物氮杂Wittig反应碳二亚胺 d1蛋白酶双酰肼杀菌活性除草活性抑制剂