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d-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

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生物工程学报 2008年第6期24卷 1004-1009页

作者：于慧敏马现锋罗晖文程沈忠耀清华大学化工系生物化工研究所北京100084 北京科技大学生物科学与技术系北京100083

d-氨基酸氧化酶(dAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高dAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达,分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母dAAO(TvdAAO)的N-端融合蛋白。其中,MBP融合蛋白MBP-TvdAAO在组成型(JM105/pM... 详细信息

d-氨基酸氧化酶(dAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高dAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达,分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母dAAO(TvdAAO)的N-端融合蛋白。其中,MBP融合蛋白MBP-TvdAAO在组成型(JM105/pMKC-dAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-dAAO)中表达时,目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右,比无MBP融合的对照菌株BL21(dE3)/pET-dAAO分别提高3.7和1.8倍;但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvdAAO在重组菌BL21(dE3)/pET-VdAAO中摇瓶诱导表达时,dAAO酶活达到了3.24u/mL,比对照菌株BL21(dE3)/pET-dAAO提高了约90%。

关键词： d-氨基酸氧化酶大肠杆菌麦芽糖结合蛋白透明颤菌血红蛋白融合表达

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中枢神经系统d-氨基酸氧化酶的研究进展

生理科学进展 2008年第1期39卷 64-66页

作者：赵文娟殷明上海交通大学药学院上海200240

新近研究证实,哺乳动物神经系统中存在内源性d-氨基酸氧化酶,参与脑内d-氨基酸的代谢。遗传学研究发现,d-氨基酸氧化酶基因与精神分裂症的发生密切相关。分子生物学研究表明,在d-氨基酸氧化酶基因启动子区域存在一些转录因子的结合位点... 详细信息

新近研究证实,哺乳动物神经系统中存在内源性d-氨基酸氧化酶,参与脑内d-氨基酸的代谢。遗传学研究发现,d-氨基酸氧化酶基因与精神分裂症的发生密切相关。分子生物学研究表明,在d-氨基酸氧化酶基因启动子区域存在一些转录因子的结合位点。这些研究结果提示,中枢神经系统的d-氨基酸氧化酶除了参与d-氨基酸的代谢以外,可能还具有其它的生理功能。本文就中枢神经系统d-氨基酸氧化酶的研究进展作一综述。

关键词： d-氨基酸氧化酶 d-氨基酸中枢神经系统疼痛精神分裂症

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d-氨基酸氧化酶的分子改造及应用研究进展

化工进展 2021年第3期40卷 1215-1225页

作者：居述云吴坚平杨立荣浙江大学化学工程与生物工程学院浙江杭州310027 浙江大学杭州国际科创中心浙江杭州311200

d-氨基酸氧化酶是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶,能够催化d-氨基酸氧化脱氢,生成相应的α-酮酸、过氧化氢和氨。该类酶在自然界中分布广泛,主要来源于真核生物和少数原核生物。作为一种经典的生物催化剂,d-氨基酸氧化酶具有... 详细信息

d-氨基酸氧化酶是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶,能够催化d-氨基酸氧化脱氢,生成相应的α-酮酸、过氧化氢和氨。该类酶在自然界中分布广泛,主要来源于真核生物和少数原核生物。作为一种经典的生物催化剂,d-氨基酸氧化酶具有反应条件温和、底物谱广泛、对映体选择性好等特点,在合成医药、农药和精细化学品等方面具有重要的应用价值。本文综述了d-氨基酸氧化酶的基本蛋白结构特征及其催化机制,重点介绍了d-氨基酸氧化酶底物特异性和热稳定性分子改造的策略和代表性成果以及该类酶在生物催化中的应用,例如制备7-氨基头孢烷酸、手性氨基酸、胺类化合物和α-酮酸。最后探讨了d-氨基酸氧化酶目前在生物催化应用过程中存在的问题。后续的研究可围绕新酶的挖掘与改造展开工作。基于对映体选择性和底物识别的分子机制,理性设计酶的催化性能,并以挖掘或改造获得的d-氨基酸氧化酶作为新酶元件,用于构建功能化学品生物合成新途径。

关键词： d-氨基酸氧化酶分子改造生物催化手性氨基酸手性胺

原玻璃蝇节杆菌d-氨基酸氧化酶及突变体的酶学特性

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微生物学报 2014年第8期54卷 897-904页

作者：冯利伟郭姣洁李辉欣徐书景鞠建松赵宝华河北师范大学生命科学学院河北石家庄050024 石家庄科技信息职业学院河北石家庄052165

【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(dSM 20168)中d-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(dSM 15035,20168)中克隆获得d-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApdAAO-2为模板,采用QuickCh... 详细信息

【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(dSM 20168)中d-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(dSM 15035,20168)中克隆获得d-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApdAAO-2为模板,采用QuickChange Site-directed Mutagenesis技术构建定点突变体,经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白,SdS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kda;酶学特性分析表明,ApdAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApdAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其它突变体为8.0-11.0;ApdAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性,除T256K的最适底物为d-Phe外,其余均为d-Met;动力学参数测定结果显示,以二级表观常数kcat/Km表示,对于底物d-Met或d-Phe,ApdAAO-2和4个突变体的kcat/Km值均比ApdAAO-1和pKdAAO高数倍以上。【结论】ApdAAO-2及突变体具有比ApdAAO-1和pKdAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率,有一定的商业应用价值。

关键词：原玻璃蝇节杆菌 d-氨基酸氧化酶定点突变二级表观常数

d-氨基酸氧化酶基因多态性与精神分裂症的关联研究

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南方医科大学学报 2010年第9期30卷 2142-2144,2147页

作者：李悦陈元堂胡江魏腊梅高海玲许昌泰西安市精神卫生中心陕西西安710061 第四军医大学神经解剖学杂志编辑部陕西西安710032

目的探讨d-氨基酸氧化酶(dAAO)基因多态性与精神分裂症的相关性。方法运用聚合酶链反应扩增及单核苷酸多态性的分子生物学技术,收集符合美国dSM-Ⅳ精神分裂症诊断标准的112个先证者及其父母组成的核心家系,对dAAO基因的rs3741775、rs382... 详细信息

目的探讨d-氨基酸氧化酶(dAAO)基因多态性与精神分裂症的相关性。方法运用聚合酶链反应扩增及单核苷酸多态性的分子生物学技术,收集符合美国dSM-Ⅳ精神分裂症诊断标准的112个先证者及其父母组成的核心家系,对dAAO基因的rs3741775、rs3825251、rs3918347、rs4964770多态性分型,进行精神分裂症的dAAO基因多态性的关联分析和单体型相对风险率分析。结果 rs3918347等位基因与精神分裂症相关联(P=0.014),其中等位基因A是保护因素(Z=-2.37),G为危险因素(Z=2.37),A等位基因频率为0.41,G为0.59;rs3741775、rs3825251、rs4964770与精神分裂症无关联。三种单体型rs3825251-rs3918347的C/G、rs3918347-rs4964770的G/T、rs3825251-rs3918347-rs4964770中的C/G/T与精神分裂症有关联(P值分别为0.021、0.036、0.028,基因型频率分别为0.33、0.28、0.15)。结论 dAAO基因与精神分裂症相关联。

关键词：精神分裂症 d-氨基酸氧化酶基因多态性关联分析

绿色荧光蛋白标记的d氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文)

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Acta Genetica Sinica 2004年第11期31卷 1175-1181页

作者：何志颖江千里陈元晓温丽敏姚玉成王新民李文林王健民胡以平第二军医大学细胞生物学教研室上海200433 第二军医大学附属长海医院血液内科上海200433 昆明医学院生物学教研室昆明650031

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母d 氨基酸氧化酶 (dAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、dAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES dAAO。脂质体法转染HeLa细... 详细信息

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母d 氨基酸氧化酶 (dAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、dAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES dAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa d。以不同浓度的前药d Ala处理HeLa d细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa d细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa d细胞。前药d Ala能明显杀伤HeLa d细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选dAAO表达载体转染的细胞 ,dAAO/d

关键词：绿色荧光蛋白 d-氨基酸氧化酶自杀基因报告基因基因表达宫颈癌

d-氨基酸氧化酶在砷致仔鼠学习记忆损伤中作用的研究

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沈阳医学院学报 2023年第5期25卷 454-457页

作者：牛泽华李金蕊张桐葛莉莉黄睿吴玉刚王艳沈阳医学院公共卫生学院辽宁沈阳110034 沈阳医学院辽宁沈阳110034 沈阳医学院公共卫生学院职业卫生与职业医学教研室辽宁沈阳110034

目的:探讨d-氨基酸氧化酶(dAAO)在砷所致仔鼠学习记忆损伤中的作用。方法:建立仔鼠砷暴露模型(60 mg/L NaAsO_(2)),出生后6周的仔鼠腹腔注射dAAO的抑制剂6-氯苯并[d]异恶唑-3-醇(CBIO)(30 mg/kg)干预2周,Real-time RT-PCR测定dAAO、突触... 详细信息

目的:探讨d-氨基酸氧化酶(dAAO)在砷所致仔鼠学习记忆损伤中的作用。方法:建立仔鼠砷暴露模型(60 mg/L NaAsO_(2)),出生后6周的仔鼠腹腔注射dAAO的抑制剂6-氯苯并[d]异恶唑-3-醇(CBIO)(30 mg/kg)干预2周,Real-time RT-PCR测定dAAO、突触素(SYP)和突触后致密物95(PSd95)mRNA表达水平,UHPLC-MS/MS法测定d-丝氨酸和L-丝氨酸水平。结果:与对照组比较,NaAsO_(2)组仔鼠海马dAAO mRNA表达水平升高而SYP和PSd95 mRNA表达水平下降(Pd-丝氨酸和L-丝氨酸水平下降(PdAAO mRNA表达水平下降而SYP mRNA表达水平升高(Pd-丝氨酸水平升高(Pd-丝氨酸水平降低和dAAO转录水平升高,抑制dAAO水平可使d-丝氨酸和突触相关蛋白SYP水平升高,从而可能改善砷暴露所致的仔鼠学习记忆损害。

关键词：砷 d-丝氨酸 d-氨基酸氧化酶学习记忆

d-氨基酸氧化酶在不同毕赤酵母宿主菌中的表达比较

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生物工程学报 2004年第4期20卷 572-577页

作者：冯美卿黄海史训龙余志良袁中一周珮复旦大学药学院中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所上海200031

d 氨基酸氧化酶 (dAAO)在转化头孢菌素C生产 7 ACA和转化dL 氨基酸制备α 酮酸和L 氨基酸上起着重要的作用。采用dNA操作技术 ,将来源于三角酵母的dAAO基因连接至表达载体pPIC3 5K上 ,再将表达质粒pPIC3 5K dAAO分别整合P .pastoris的... 详细信息

d 氨基酸氧化酶 (dAAO)在转化头孢菌素C生产 7 ACA和转化dL 氨基酸制备α 酮酸和L 氨基酸上起着重要的作用。采用dNA操作技术 ,将来源于三角酵母的dAAO基因连接至表达载体pPIC3 5K上 ,再将表达质粒pPIC3 5K dAAO分别整合P .pastoris的宿主细胞KM71和GS1 1 5 ,经筛选获得阳性重组菌PdK1 3(MutS)和Pd2 7(Mut+ )。重点对两种突变菌的表达条件进行了比较。结果显示 :PdK1 3(MutS)株比Pd2 7(Mut+ )株消耗甲醇慢、诱导时间长 ,但对通气量要求低、表达水平高 ,摇瓶活力分别达到 2 70 0和 2 5 0 0IU L ,1 4L发酵罐内活力分别达到 1 0 1 4 0和 84 6 3IU L。初步探索了dAAO对dL 苯丙氨酸的拆分 ,结果显示基因工程菌表达的dAAO具有良好的转化dL 苯丙氨酸制备苯丙酮酸和L

关键词： d-氨基酸氧化酶甲醇酵母不同宿主菌表达比较 dL-苯丙氨酸拆分

基因工程酵母菌来源的d-氨基酸氧化酶分离纯化

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复旦学报（医学版） 2005年第1期32卷 71-74,85页

作者：史训龙冯美卿贺佳音袁中一周珮复旦大学药学院生物合成药物化学教研室上海200032 浙江大学生命科学院生物技术系杭州310029 中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所上海200031

目的以基因工程酵母表达的胞内d-氨基酸氧化酶(dAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化dAAO。方法采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经 dEAE Sephadex A-50,dEAE-dE52,Q-sepharose等... 详细信息

目的以基因工程酵母表达的胞内d-氨基酸氧化酶(dAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化dAAO。方法采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经 dEAE Sephadex A-50,dEAE-dE52,Q-sepharose等离子交换柱进行第一步分离,获得的含酶粗品,再经Sephaciyl S-100分子筛进一步纯化获得电泳纯的dAAO。结果超声波破壁为最佳的破壁方法,得到的每毫升酶液所含的酶活力是其他破壁方法的两倍以上,最高达到12 000 U／mi,。两步硫酸铵沉淀能粗分dAAO,50％硫酸铵沉淀酶回收率可达85％以上。用Q-sepharose、Sephacryl S-100分子筛柱层析两步纯化,酶活力回收率最高可达 90％,SdS-PAGE显示单一蛋白条带。结论本实验方法能得到电泳纯的dAAO,总回收率约为40％。

关键词： S-100 细胞法能透析分离纯化电泳表达硫酸铵沉淀基因工程酵母 d-氨基酸氧化酶