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肽配基仿生亲和介质的制备与抗体纯化性能研究

肽配基仿生亲和介质的制备与抗体纯化性能研究

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作者：贾立霞天津大学

学位级别：硕士

近年来,单克隆抗体因其高特异性高和低免疫原性而被广泛应用于疾病的诊断与治疗中,并展现出广阔的市场前景。蛋白A层析则因其配基与抗体的高特异性结合而成为抗体分离纯化过程的“黄金标准”。然而,蛋白A层析应用中也存在着配基价格昂... 详细信息

近年来,单克隆抗体因其高特异性高和低免疫原性而被广泛应用于疾病的诊断与治疗中,并展现出广阔的市场前景。蛋白A层析则因其配基与抗体的高特异性结合而成为抗体分离纯化过程的“黄金标准”。然而,蛋白A层析应用中也存在着配基价格昂贵、配基稳定性差及易脱落和洗脱条件苛刻等一系列问题。因此,寻找蛋白A替代配基迫在眉睫。为进一步提高仿生多肽亲和介质的性能,本文在前期工作的基础上,利用筛选出的仿生八肽-FYWHCLdE,将多肽配基中的氨基酸用其对映体氨基酸替代,开展了如下研究工作:首先,本文考察了游离的L-FYWHCLdE和d-FYWHCLdE两种多肽配基在α-胰凝乳蛋白酶存在条件下的稳定性,然后将其偶联到基质Sepharose 6 Fast Flow上,考察了亲和介质在不同p H条件下对h Ig G的静态吸附性能。酶稳定性实验结果表明,L-FYWHCLdE多肽配基在与α-胰凝乳蛋白酶共同孵育8 h后,超过50%的多肽配基被降解,而d-FYWHCLdE多肽配基仅被降解了8%左右,说明d型多肽配基具有更高的酶稳定性。静态吸附实验结果表明,改变氨基酸的构型并未影响亲和介质对h Ig G的特异性和亲和力,两种亲和介质均在p H 6.0条件下获得最大静态吸附容量,L型和d型亲和介质的饱和吸附容量分别为111.32 mg/m L和129.81 mg/m L。然后,本文将d型亲和介质用来从细胞培养上清液中分离纯化单克隆抗体,考察了洗脱缓冲液中盐浓度对抗体分离纯化的影响。研究结果表明,在平衡缓冲液中添加0.5 mol/L的Na Cl作为洗脱缓冲液时可获得最高回收率(94.97%)和纯度(大于98%),在该条件下,从人血清中分离Ig G可获得纯度大于90%和回收率大于85%的抗体产品,其较单克隆抗体均略有降低。这是因为血清中存在多种抗体,而此多肽配基对多种类型的抗体都有亲和性。本文考察了两种亲和介质从血清中纯化Ig G的操作性能。经过40个循环和经0.1 mol/L Na OH原位洗脱12h后,dBC的降低程度存在明显差异,d型亲和介质的可重复利用率和耐碱性均高于L型亲和介质。以上结果表明非天然氨基酸构成的多肽配基更加稳定,有助于提高亲和介质的使用寿命,显示出分离纯化抗体的巨大潜力。

关键词： d型多肽配基分离纯化盐浓度酶稳定性碱稳定性

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