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Effect and mechanism of cypa in radiosensitization of lung adenocarcinoma using CRISPR/Cas9 technology

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Journal of Traditional Chinese Medical Sciences 2020年第1期7卷 53-58页

作者： Jinkun Ma Lin Xu Jinchang Huang Qiaoli Zhang Yuqin Qiu Xuewei Qi Lina Wang Yuchan Cao Zeyu Liu Shiyun Liu Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital Beijing University of Chinese MedicineBeijing100029China

Objective:To explore the role of cyclophilin A(cypa)in sensitization of lung adenocarcinoma to radiotherapy using CRISPR/Cas9 ***:A cypa knockout human lung adenocarcinoma cell line H1975 was established by CRISPR/Cas9 *** included a control group(wildtype),cypa knockout group,traditional Chinese medicine(TCM)extract with Fuzhengzengxiao decoction group,and TCM extract with Fuzhengzengxiao decoction t cypa knockout *** group was exposed to radiation at doses of 0,2,4,6,and 8 *** 24 h,MTT assays were used to determine the survival rate of lung cancer cells and calculate *** qPCR was used to measure mRNA expression of DDIT3,CDKN1A,and CDC25A associated with DNA damage ***:Without irradiation,Fuzhengzengxiao decoction reduced the survival rate of lung adenocarcinoma cells(Pcypa knockout,and TCM extract with Fuzhengzengxiao decoction t cypa knockout groups had reduced survival rates(Pcypa(Pcypa knockout group also had increased expression of DDIT3 and CDC25A after irradiation(Pcypa and inducing G1/S cell cycle arrest.

关键词： cypa Fuzhengzengxiao decoction Gene knockout Lung adenocarcinoma Radiosensitization

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)cypa基因应答WSSV侵染的表达研究

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海洋与湖沼 2018年第4期49卷 910-918页

作者：朱俊杰林锋王岩张海琪浙江大学杭州310058 湖州师范学院湖州313000 浙江省淡水水产研究所湖州313001

克氏原螯虾亲环素蛋白A(Procambarus clarkii Cyclopllilin A,简称Pccypa)是一种存在于克氏原螯虾(***)中高度保守的重要蛋白,具有多种生物学功能。为了初步阐明cypa在病毒侵染克氏原螯虾过程中的免疫应答机制,本研究利用qRT-PCR等技术... 详细信息

克氏原螯虾亲环素蛋白A(Procambarus clarkii Cyclopllilin A,简称Pccypa)是一种存在于克氏原螯虾(***)中高度保守的重要蛋白,具有多种生物学功能。为了初步阐明cypa在病毒侵染克氏原螯虾过程中的免疫应答机制,本研究利用qRT-PCR等技术分析了克氏原螯虾在WSSV病毒感染后,Pccypa在不同组织中的转录表达情况。研究结果表明克氏原螯虾在感染WSSV后,心脏和肌肉组织中都出现了肌纤维断裂溶解的情况,在肝胰腺组织中出现了脂肪颗粒脱落、细胞空泡化和细胞膜溶解现象。同时,不同组织中的Pccypa基因表达存在明显的时序差异,以24hpi为界,0—24hpi为注射应激期,在此期间,肝胰腺、心脏等组织中的Pccypa转录表达量均有上调;24—36hpi为应激恢复期,绝大多数的组织中Pccypa转录表达均出现了回落,但在心脏、肌肉、血淋巴组织中出现了上调,说明这三个组织对WSSV感染的响应可能早于其他组织;48hpi之后为病毒感染响应阶段,在此期间鳃和肌肉组织中Pccypa表达量显著提升,而在肝胰腺和精巢组织中却出现表达下调;96—120hpi为感染响应后期阶段,肝胰腺和肠组织的Pccypa转录水平再次上调。因而,可以初步推断Pccypa在病毒WSSV侵染克氏原螯虾过程中参与了机体的免疫应答,且在不同的组织中Pccypa的转录表达水平存在显著差异。

关键词：克氏原螯虾 cypa qRT-PCR WSSV

cypa在扶正增效方对肺腺癌放射增敏中作用及其机制

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中华中医药杂志 2015年第2期30卷 398-401页

作者：张巧丽吴桐雷勇刘为易田叶红赵伟鹏黄金昶北京市和平里医院北京100013 北京中医药大学北京100029 中国中医科学院西苑医院北京100091 中日友好医院北京100029

目的:探讨Cy PA在扶正增效方对肺腺癌放射增敏中发挥的作用和地位。方法:建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,当瘤体积达1cm3左右时,一次性给予放射组、中药+放射组瘤体10Gy剂量照射,观察抑瘤率,通过Western blot和Real-time PCR检测Cy PA表达... 详细信息

目的:探讨Cy PA在扶正增效方对肺腺癌放射增敏中发挥的作用和地位。方法:建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,当瘤体积达1cm3左右时,一次性给予放射组、中药+放射组瘤体10Gy剂量照射,观察抑瘤率,通过Western blot和Real-time PCR检测Cy PA表达。结果:Cy PA在中药对肺腺癌放射增敏中的蛋白和m RNA表达检测发现,与对照组比较各组表达均有所下降,尤其放射24h后中药加放射组表达显著降低(P<0.05)。结论:Cy PA在中药对肺腺癌放射增敏中发挥着重要作用。

关键词： cypa 扶正增效方肺腺癌放射增敏

cypa在肺泡巨噬细胞泡沫化调节矽肺纤维化形成中的作用研究

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CypA在肺泡巨噬细胞泡沫化调节矽肺纤维化形成中的作用研究

作者：田盈华北理工大学

学位级别：硕士

目的探讨亲环素A(cypa)在游离二氧化硅(SiO)诱导巨噬细胞泡沫化中的作用及其作用机制,从而进一步研究巨噬细胞泡沫化对矽肺纤维化的影响。方法第一阶段实验,使用100 ng/ml的豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)将处于对数期生长的人周围血单核细胞(... 详细信息

目的探讨亲环素A(cypa)在游离二氧化硅(SiO)诱导巨噬细胞泡沫化中的作用及其作用机制,从而进一步研究巨噬细胞泡沫化对矽肺纤维化的影响。方法第一阶段实验,使用100 ng/ml的豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)将处于对数期生长的人周围血单核细胞(THP-1),诱导分化为THP-1源性的巨噬细胞,培养48 h后,分为4个实验组:空白对照组细胞不做任何处理,给与ox-LDL对照组的培养基含终质量浓度50μg/ml的ox-LDL的培养基,给与50μg/ml SiO组的培养基含终质量浓度50μg/ml的SiO和50μg/ml ox-LDL的培养基,给与100μg/ml SiO组的培养基含终质量浓度为100μg/ml的SiO和50μg/ml的ox-LDL,培养48 h后,通过MIC测试条法检测细胞活力,通过油红O染色法和胆固醇试剂盒法观察巨噬细胞脂质蓄积的情况,酶联免疫吸附实验法检测巨噬细胞上清液中cypa表达情况,以蛋白质印迹法检测细胞中cypa表达的情况。第二阶段实验,用同样的方法建立泡沫细胞模型,采用慢病毒转染使cypa过表达,设立组别为空白对照组(Control,不做任何处理),过表达组(OE,过表达病毒),阴性对照组(NC,100μg/ml SiO+50μg/mlox-LDL+对照病毒),过表达实验组(OE+T,100μg/ml SiO+50μg/mlox-LDL+过表达病毒);采用基因沉默的方法使cypa低表达,设立组别为对照组(Control,不做任何处理),Sicypa组(Sicypa),阴性对照组(NC,NC+100μg/ml SiO+50μg/mlox-LDL),Sicypa实验组(Sicypa+T,Sicypa+100μg/ml SiO+50μg/mlox-LDL),培养48h。采用第一阶段的方法检测cypa的表达变化以及泡沫化情况。在第三阶段,基于亲环蛋白A的过表达,CD36途径被阻断,细胞随机分为以下四个实验组:对照组(DMSO),SSO抑制剂组(5μM SSO),模型组(DMSO+SiO+ox-LDL)以及SSO实验组(SSO+SiO+ox-LDL),每个组培养48h。使用与第一阶段相同的方法观察细胞泡沫化情况。将第一、二、三阶段的各组别细胞的上清培养人肺成纤维细胞(HFL-1),蛋白质印迹法检测细胞中胶原蛋白1(COLⅠ)和a平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平。结果1 MTS结果显示:与对照组比较,SiO质量浓度为100μg/ml时细胞活力最强。2油红O染色结果显示,与空白对照组相比,100μg/ml SiO组细胞泡沫样变化显着。3与空白对照组比较,ox-LDL对照组、50μg/ml SiO组、100μg/ml SiO组细胞内TC、FC表达水平均升高(Pcypa在细胞内表达水平均降低(Pcypa表达水平均升高(Pcypa过表达模型构建成功后,与NC相比,细胞上清液中cypa表达明显增多(Pcypa基因沉默后,与NC组相比,上清液中cypa表达降低(Pcypa+T组橘红色脂滴明显减少,与NC组相比,Sicypa+T组细胞内TC、FC表达水平均降低(Pcypa+T组COLⅠ和α-SMA蛋白水平均降低(Pcypa在巨噬细胞泡沫化过程中的表达发生变化。2 cypa在巨噬细胞泡沫化过程中发挥一定作用。3 cypa发挥作用过程可能与介导CD36表达有关。4巨噬细胞泡沫化可介导矽肺纤维化过程。图32幅;表12个;参139篇。

关键词： SiO2 泡沫细胞 cypa CD36 矽肺纤维化

蒙花散对急性心肌梗死大鼠心功能及心肌cypa、XBP1、p-ERK、HO-1蛋白表达的影响

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中药材 2021年第4期44卷 949-953页

作者：黄守莲袁艺阳春芳马霞刘莉淡雪川四川省宜宾市第二人民医院/四川大学华西医院宜宾医院四川宜宾644000

目的:探索蒙花散对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能及心肌cypa、XBP1、p-ERK、HO-1蛋白表达的影响。方法:80只SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组及蒙花散低、中、高剂量组,戊巴比妥钠麻醉后,采用左冠状动脉前降支穿线并结扎的方式制备AM... 详细信息

目的:探索蒙花散对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能及心肌cypa、XBP1、p-ERK、HO-1蛋白表达的影响。方法:80只SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组及蒙花散低、中、高剂量组,戊巴比妥钠麻醉后,采用左冠状动脉前降支穿线并结扎的方式制备AMI大鼠模型,蒙花散各剂量组灌胃相应剂量蒙花散,假手术组和模型组灌胃相应体积生理盐水,连续给药6 w后,比较各组大鼠心脏功能指标,血清SOD、MDA、CK-MB、cTnⅠ水平,炎性因子、凝血因子,心脏组织cypa、XBP1、p-ERK、HO-1蛋白表达,心肌组织氧化应激指标SOD、MDA。结果:与模型组比较,蒙花散各剂量组SBP、DBP、LVSP、LVFS、LVEF、±dp/dt_(max)、AT-Ⅲ及血清SOD、HMGB1和心肌组织p-ERK、HO-1显著升高,LVEDD、LVESD、QT间期、T波幅度、ST段抬高幅度显著降低,心肌组织MDA水平及cypa、XBP1蛋白表达显著降低,血清MDA、CK-MB、cTnⅠ、TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6、MMP-9、β-TG、FPA、DD、GMP-140、BNP水平显著降低(Pcypa、XBP1、p-ERK、HO-1蛋白表达具有较好的改善作用,可减轻机体氧化应激水平和心肌损伤程度。

关键词：蒙花散急性心肌梗死心功能 cypa XBP1 p-ERK HO-1

cypa酵母表达载体的构建及在毕赤酵母X-33中的表达纯化

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CypA酵母表达载体的构建及在毕赤酵母X-33中的表达纯化

作者：田爽山东大学

学位级别：硕士

研究背景：亲环素A （cypa）于1984年首次从牛的胸腺中提取获得,是环孢霉素亲和素家族成员之一。cypa由165个氨基酸组成,分子量为18,000,广泛分布在细胞内、细胞外。作为环孢素A （CsA）细胞内受体,后者在临床上可以用作器官移植后排异... 详细信息

研究背景：亲环素A （cypa）于1984年首次从牛的胸腺中提取获得,是环孢霉素亲和素家族成员之一。cypa由165个氨基酸组成,分子量为18,000,广泛分布在细胞内、细胞外。作为环孢素A （CsA）细胞内受体,后者在临床上可以用作器官移植后排异反应及自身免疫性疾病的治疗药物。cypa具有肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性,参与信号转导,调节多种蛋白活性,起着分子伴侣的作用,并在DNA分子的复制、转录、细胞信号转导、微管形成和修复过程中起到重要作用。炎症和氧化应激是许多疾病主要致病机制。氧自由基是氧化应激的主要标志物,其中与氧化应激最为密切是活性氧簇（ROS）。在心血管系统中,炎症及氧化应激过程已被认为是动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄以及糖尿病性血管病变等心血管病变等心血管疾病的重要促进因素,目前抗氧化治疗对氧化应激损伤所致的心血管疾病无明显疗效,主要因为维生素C及维生素E及其它抗氧化剂在心血管组织中并无特异性。因此探索新的特异性氧化损伤介质及其作用机制对于治疗炎症及氧化应激介导的心血管疾病有重要意义。新近研究表明,cypa是一主要分泌型氧化应激诱导因子（SOXF）,在大鼠颈动脉损伤模型、腹主动脉瘤形成、动脉粥样硬化、心肌重塑等心血管疾病发病机制中发挥关键作用[1]。本课题主要通过构建pPICZaB-cypa酵母表达载体,转化X-33毕赤酵母,甲醇诱导表达,然后纯化该蛋白并验证其生物学功能,为进一步研究cypa介导的心血管疾病奠定实验基础。研究目的：1、构建pPICZaB-cypa表达载体,转化毕赤酵母细胞,通过甲醇诱导其表达,纯化分离该蛋白。2、鉴定其具有生物学功能,以用于后续试验。研究方法：1、依据Genbank序列,设计并合成PCR引物,利用RT-PCR获取人cypa目的片段;将PCR产物克隆到peasy-blunt-zero载体,形成peasy-blunt-cypa载体,少量提取质粒,经酶切鉴定及测序鉴定,选出正确克隆;质粒peasy-blunt-cypa经BamH I/Not I酶切,凝胶回收、PCR补平粘性末端获取目的片段;载体pPICZ a B经Kpnl单酶切、补平粘性末端、去磷酸化后回收,获得线性化载体。2、将目的cypa片段与线性化pPICZ a B载体连接,利用酵母转化试剂盒转化酵母细胞,甲醇诱导其分泌表达,在合适的时间点分别取上清进行Western检测表达情况;3、Western证实其表达后,再通过DEAE阳离子交换法纯化分离cypa蛋白,Western检测纯化情况;4、利用Transwell验证纯cypa蛋白对THP-1细胞的趋化作用。研究结果：1、通过酶切及测序验证表达载体的正确性;2、将表达载体pPICZ a B-cypa转化酵母细胞,甲醇诱导目的蛋白表达,Western检测到上清中含有目的蛋白条带,并且其分泌量随诱导时间增长而逐渐增多,表明外源性cypa在酵母细胞真核表达系统中能够表达,并且能分泌到上清中。3、由于cypa的等电点PI=8.79,使用DEAE阳离子交换树脂纯化目的蛋白,Western显示近似单一的目的条带,表明该方法可以有效去除杂蛋白,cypa得到较好的纯化,4、利用transwell及DAPI染色验证纯化的cypa蛋白是否具有生物学活性,实验组小室下壁细胞数与对照组相比有一定的增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）,说明cypa对THP-1细胞有一定的趋化作用。实验结论：1.成功构建了pPICZaB-cypa的表达载体。2.转化毕赤酵母细胞,并且能够成功分泌表达目的蛋白cypa。3.利用DEAE阳离子交换可以有效纯化cypa蛋白。4.重组cypa蛋白对THP-1细胞有一定的趋化作用。

关键词：毕赤酵母细胞 cypa 表达载体蛋白纯化

cypa在大鼠重症急性胰腺炎肺损伤中表达意义研究

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CyPA在大鼠重症急性胰腺炎肺损伤中表达意义研究

作者：杨保祥昆明医科大学

学位级别：硕士

[研究背景l 急性胰腺炎(AP)是常见的外科急腹症,其中15-20%可发展为重症急性胰腺(SAP)。重症急性胰腺炎是于一种累及多种脏器的全身性疾病,起病急,进展快,病情复杂,并发症多,病死率高。近年来SAP的发病率有所上升,易早期并发器官功能衰... 详细信息

[研究背景l 急性胰腺炎(AP)是常见的外科急腹症,其中15-20%可发展为重症急性胰腺(SAP)。重症急性胰腺炎是于一种累及多种脏器的全身性疾病,起病急,进展快,病情复杂,并发症多,病死率高。近年来SAP的发病率有所上升,易早期并发器官功能衰竭(MOF),其中最常见的是重症急性胰腺炎合并肺损伤。目前认为,重症急性胰腺炎合并多器官损伤发病机制中,白细胞尤其是中性粒细胞(PMN)的过度激活发挥十分关键的作用。组织中PMN在炎症介质作用下其凋亡延迟、持续过度激活、继而继发坏死,释放的大量炎性介质和细胞因子,进一步损伤微血管内皮细胞,破坏内皮细胞的完整性,最终引起肺血管通透性增加,造成肺间质水肿、出血,肺出血坏死及肺泡透明膜形成。研究认为SAP中,PMN致病过程多由有趋化功能的细胞因子所介导。亲环素A(cypa)是一种新近发现的极其重要的PMN趋化因子,CD147为其传递信号途径的膜受体。一些炎症疾病中,血清cypa表达水平明显增加,与疾病的严重程度或疾病的活动性呈正相关。cypa与效应细胞表面的CD147相互作用,调控炎症反应的发生和发展。但是cypa在SAP及其靶器官损伤发生发展中的作用尚不明确。 [目的] 探讨SAP中血清cypa表达的意义,分析其与组织损伤及PMN浸润的关系,探讨血清cypa的测定在评估重症急性胰腺炎肺损伤严重程度及预后的意义。 [方法] 健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只随机分为假手术组(SO组),轻症胰腺炎组(MAP组)及重症急性胰腺炎组(SAP组)各组18只。假手术组(SO组)：开腹后轻轻翻动十二指肠和胰腺,关腹;轻症胰腺炎组(MAP组)：以0.5%牛磺胆酸钠(1.0mL/kg)逆行胰胆管注射诱导MAP模型;重症急性胰腺炎组(SAP组)：以5%牛磺胆酸钠(1.0mL/kg)逆行胰胆管注射诱导SAP模型。各组分别于术后3h、6h、12h随机选择6只大鼠处死,收集血清、胰腺和肺组织标本。血清用于测定淀粉酶(AMS)活性及ELISA法测定血清cypa水平;胰腺及肺组织做病理切片行病理学观察并评分,分光光度计测定胰腺和肺组织中髓过氧化酶(MPO)活性,分析cypa与胰腺炎症及肺损伤严重程度及PMN浸润的相关性。 [结果] 1.与SO组比较,MAP组及SAP组各时间点血清AMS水平均显著升高,胰腺损伤病理学评分显著增加(P0.05)。因此,采用不同浓度的牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射成功地建立了SAP合并肺损伤及MAP大鼠模型。 2.与SO、MAP组比较,SAP组各时间点血清cypa水平与胰腺损伤的严重程度正相关(3h:rs=0.836, p＜0.01;6h:rs=0.783, P＜0.01;12h:rs=0.871, P＜0.01)。与SO、MAP组比较,SAP组各时间点血清cypa水平与肺组织损伤的严重程度正相关(3h:rs=0.893, p＜0.01;6h:rs=0.926, P＜0.01;12h:rs=0.827, P＜0.01)。 3.与SO组、MAP组比较,SAP组各时间点胰腺及肺组织MPO活性显著增加(Pcypa水平与胰腺及肺组织MPO活性呈正相关(胰腺：3h r=0.820,p＜0.01,6h r=0.872, P＜0.01,12hr=0.918, P＜0.01;肺：3h r=0.839, P＜0.01,6h r=0.759, P＜0.01,12h r=0.841, P＜0.01)。 [结论] SAP中血清cypa表达增加,可作为评估SAP严重程度、预后及肺组织损伤的又一早期指标。

关键词： SAP cypa 肺损伤 MPO

cypa高表达与奥沙利铂耐药性的研究并胸腺瘤病例报道一例

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CyPA高表达与奥沙利铂耐药性的研究并胸腺瘤病例报道一例

作者：张颖大连医科大学

学位级别：硕士

实验目的：研究人结肠癌细胞株HCT116在外源性基因cypa（cyclophilin A）过表达的作用下，讨论肿瘤细胞HCT116对奥沙利铂药物的敏感性的影响，及高表达外源性cypa后肿瘤细胞HCT116-cypa周期分布的变化。实验方法：1.应用本实验室已建构... 详细信息

实验目的：研究人结肠癌细胞株HCT116在外源性基因cypa（cyclophilin A）过表达的作用下，讨论肿瘤细胞HCT116对奥沙利铂药物的敏感性的影响，及高表达外源性cypa后肿瘤细胞HCT116-cypa周期分布的变化。实验方法：1.应用本实验室已建构的，含有完整cypa基因序列的，并携带Myc标签基因的真核表达质粒pcmv-cypa，采用脂质体瞬时转染HCT116肿瘤细胞。2.采用western blot的方法鉴定转染目的基因pcmv-cypa、空载体pcmv后，转染后肿瘤细胞的cypa蛋白表达水平。3.采用流式细胞仪法检测转染目的基因cypa、空载体的肿瘤细胞的细胞周期分布。4.应用不同浓度梯度的奥沙利铂药物处理转染后的细胞,用四甲基偶氮唑盐(4,5-dimethylth iazoleo r2,5-diphenylte trazoilumb romid,MTT)法检测药物对转染目的基因cypa及转染空载体pcmv的细胞的抑制率。5.在32μg/mL的奥沙利铂药物作用12h后，流式检测转染细胞的凋亡率的变化。实验结果：1.转染目的基因细胞HCT116-cypa的cypa表达水平较转染空载体细胞HCT116-pcmv细胞cypa表达显著升高。2.与对照组HCT116-pcmv相比，实验组肿瘤细胞周期分布表现为，G1期细胞呈下降趋势，S期细胞呈上升趋势，G2细胞无明显变化，实验重复三次后，统计学分析数据发现目的基因实验组与对照组相比具有显著性差异（P cypa细胞较转染空载体组HCT116-pcmv的细胞成活数量更多，药物对细胞的抑制率更低（P0.05）。4.在32μg/mL的奥沙利铂药物作用12小时后，HCT116-cypa的凋亡率较转染空载体组细胞HCT116-pcmv的凋亡率明显降低（Pcypa可影响肿瘤HCT116细胞周期的分布，低表达cypa较高表达cypa的细胞其细胞周期落后，cypa过表达可以促进HCT116细胞周期由G1向S期的转变。MTT实验结果显示，cypa高表达的细胞具有抵抗奥沙利铂药物促凋亡的作用，其药物抑制率较转染空载体组更低（P<0.05）。在后续的流式试验中，再次印证MTT实验结果。目的探讨胸腺瘤合并单纯红细胞再生障碍性贫血的治疗方法。方法对1例胸腺瘤切除活检后明确病理，8年后肿瘤复发，行化疗、免疫调治疗。结果患者术后复发后，行4周期化疗（具体方案为：多西他赛120mg+顺铂40mgd2-4），患者病程进展，出现并发症：红细胞再生障碍性贫血，经环孢素免疫抑制治疗，联合原化疗方案治疗后，患者红细胞数、血红蛋白回升，复查CT，患者疗效评价PR。治疗治疗耐受性较好。结论胸腺瘤(thymoma)是前纵隔最常见的前上纵隔肿瘤，单纯红细胞再生障碍性贫血是胸腺瘤的并发症之一，其诊断主要依赖影像学及血细胞检查，应与其他免疫性贫血性疾病相鉴别。患者行胸腺切除术后，术后8年肿瘤复发，后化疗4个周期病情进展出现纯红细胞再障。应用环孢素调节免疫治疗，并继续应用原方案化疗3个周期后，患者病情得到有效控制，并逆转原化疗方案耐药性。复查CT，疗效评价：PR。

关键词：胸腺瘤红细胞再生障碍性贫血环孢素化疗耐药逆转奥沙利铂耐药 cypa HCT116

生殖支原体黏附蛋白MgPa通过cypa-CD147调控PI3K/Akt/NF-κB途径抑制尿道上皮细胞凋亡

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生殖支原体黏附蛋白MgPa通过CypA-CD147调控PI3K/Akt/NF-κB途径...

作者：廖雅婷南华大学

学位级别：硕士

研究背景:生殖支原体(***,Mg)是一种主要经性接触传播引起泌尿生殖道感染的原核细胞型微生物。Mg可以通过与宿主细胞膜表面的受体蛋白相互作用而黏附甚至侵入细胞内。生殖支原体黏附蛋白(*** protein of adhesion,MgPa)在Mg对宿主细胞... 详细信息

研究背景:生殖支原体(***,Mg)是一种主要经性接触传播引起泌尿生殖道感染的原核细胞型微生物。Mg可以通过与宿主细胞膜表面的受体蛋白相互作用而黏附甚至侵入细胞内。生殖支原体黏附蛋白(*** protein of adhesion,MgPa)在Mg对宿主细胞的粘附过程中发挥关键作用,病原微生物上的黏附蛋白和宿主细胞上相应的受体结合是成功建立病原体感染的前提。而我们前期研究表明人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)表面的亲环蛋白A(Cyclophilin A,cypa)是MgPa的受体。因此,本研究致力于了解MgPa通过与其细胞受体cypa相互作用对尿道上皮细胞凋亡产生的影响,为了解Mg在宿主细胞内生存的机制提供实验依据。研究目的:研究MgPa是否通过cypa-CD147对尿道上皮细胞凋亡产生影响以及其发挥作用的相关通路,以阐明Mg感染早期胞内生存的机制。研究方法:1.探究MgPa抑制或促进SV-HUC-1细胞的凋亡。使用星形孢菌素(Staurosporine,STS)作为凋亡阳性对照,以20μg/m L MgPa蛋白刺激细胞后,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,WB检测各组细胞凋亡相关分子Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平。2.探究cypa和CD147在MgPa抑制SV-HUC-1细胞凋亡中发挥的作用。将细胞分别转染cypa-si RNA和CD147-si RNA,以control-si RNA为对照,再分别使用MgPa和/或STS处理细胞后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,WB检测各组细胞Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平。3.探究MgPa是否是通过cypa-CD147调控PI3K/Akt/NF-κB途径来抑制SV-HUC-1细胞的凋亡。分别使用MgPa和/或STS处理细胞后,WB检测各组细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-IκB和IκB的表达水平。以PI3K抑制剂LY294002或DMSO对照预处理细胞后,使用MgPa和STS处理细胞,WB检测p-IκB和IκB的表达水平。使用PI3K抑制剂LY294002以及IκB抑制剂BAY 11-7082预处理细胞后,再分别使用MgPa和/或STS处理细胞,WB检测各组细胞Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平。为了验证MgPa通过cypa与CD147来调控PI3K/Akt/NF-κB途径,将细胞分别转染cypa-si RNA、CD147-si RNA后,再分别使用MgPa和/或STS处理细胞,WB检测各组细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-IκB和IκB的表达水平。4.为了进一步验证MgPa经cypa抑制细胞凋亡,构建cypa基因敲除C57BL小鼠,通过胶原蛋白酶I消化法获取小鼠原代尿道上皮细胞,分别使用MgPa和/或STS处理正常小鼠原代尿道上皮细胞以及cypa基因敲除C57BL小鼠原代尿道上皮细胞后,使用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。研究结果:***的结果证明,与未处理组细胞相比,MgPa处理组细胞的Bax和cleaved caspase 3的表达明显下调;STS诱导细胞凋亡后,MgPa处理组细胞的Bax和cleaved caspase 3的表达水平显著低于STS诱导剂组细胞Bax和cleaved caspase 3的表达水平;流式细胞术的结果显示STS诱导细胞凋亡后,MgPa处理组细胞的凋亡率(8.79%)显著低于STS诱导剂组细胞的凋亡率(16.59%)。***结果显示,转染cypa-si RNA或CD147-si RNA后,MgPa与STS共处理组细胞的Bax和cleaved caspase 3的表达水平显著高于未转染组细胞Bax和cleaved caspase 3的表达水平。流式细胞术的结果显示转染cypa-si RNA或CD147-si RNA后,MgPa与STS共处理组细胞的凋亡率分别为42.8%和46.4%,显著高于未转染组细胞的凋亡率24.63%;干扰cypa或CD147的表达明显逆转了MgPa对STS诱导的细胞凋亡的抑制作用。***诱导细胞凋亡后,MgPa处理组细胞的p-PI3K、p-Akt和p-IκB显著上调;PI3K抑制剂处理后,p-IκB表达水平下调。与未加抑制组相比,PI3K与IκB抑制剂处理后,MgPa与STS共处理组细胞的Cleaved Caspase-3表达水平显著上调;与未转染组细胞相比,转染cypa-si RNA或CD147-si RNA后,MgPa与STS共处理组的p-PI3K、p-Akt和p-IκB的表达水平显著下调。4.流式细胞术的结果表明,MgPa处理细胞36h后,

关键词：生殖支原体 MgPa 凋亡 SV-HUC-1 PI3K/Akt/NF-κB cypa cypa敲除小鼠