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TaqMan探针三重实时荧光定量PCR法同步检测CymMV、ORSV和cymrsv

TaqMan探针三重实时荧光定量PCR法同步检测CymMV、ORSV和CymRSV

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第十七届中国球宿根花卉年会

作者：孙爱青王丽花张艺萍杨秀梅魏怡杨冬李文涵陆江吴学尉云南省农业科学院花卉研究所云南大学

为建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymM V)、齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)和建兰环斑病毒(Cynbidium ringspot vivus,cymrsv)携带情况的高效检测方法,本研究分别比对了10条CymMV,15条ORSV和5条cymrsv的CP(coat protein)基因序列,利用各自的高度保守区设计引物探针并筛选,获得156bp、148bp和145bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合。以各自靶标序列为模板构建阳性重组混合质粒,优化反应条件,建立了三重TaqMan实时荧光定量PCR检测体系,并探究其灵敏度、特异性、稳定性及应用效果。结果显示:构建的CymMV,ORSV和cymrsv标准曲线线性方程分别为y(CymMV)=-3.336x+41.789,y(ORSV)=-3.319x+41.901,y(cymrsv)=-3.332x+41.202,扩增效率分别为99.4%、100.1%、99.6%,相关系数均为0.999,3个病毒的标准曲线线性关系良好;最低检出限分别为1 copy,10 copies和1 copy,最低稳定检出限分别为10 copies、10～2 copies和10～2 copies,检测灵敏度是RT-PCR的10～10～4倍;与其他6种病毒反应均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Cq值变异系数分别小于0.55%和0.95%,表明该方法具有较高的可靠性和准确性。此外,利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品开展方法验证,三重同步法比基因芯片法的检出提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上,本研究建立的基于Taqman的三重实时荧光定量PCR检测技术体系特异性强、灵敏度高,且能高通量定量分析目标病毒载量,对于批量样品的CymMV、0RSV和cymrsv同步高效检测、痕量病毒的早期监测意义重大,本研究可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术撑。

关键词：三重qRT-PCR CymMV ORSV cymrsv 病毒检测兰花

来源： cnki会议评论

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