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Activation of Sonic Hedgehog Signaling Pathway in S-type Neuroblastoma Cell Lines

Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences) 2010年第3期30卷 271-277页

作者：周昱男戴若连毛玲夏远鹏姚玉芳杨雪胡波 Department of Neurology Union HospitalTongji Medical CollegeHuazhong University of Science and Technology

The effects of Sonic hedgehog(Shh) signaling pathway activation on S-type neuroblastoma(NB) cell lines and its role in NB tumorigenesis were investigated.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Shh pathway components— Patched1(PTCH1) and Gli1 in 40 human primary NB samples.Western blotting and RT-PCR were used to examine the protein expression and mRNA levels of PTCH1 and Gli1 in three kinds of S-type NB cell lines(SK-N-AS,SK-N-SH and SHEP1),respectively.Exogenous Shh was administrated to activate Shh signaling pathway while cyclopamine was used as a selective antagonist of Shh pathway.S-type NB cell lines were treated with different concentrations of Shh or/and cyclopamine for different durations.Cell viability was measured by using MTT method.Apoptosis rate and cell cycle were assayed by flow cytometry.The xenograft experiments were used to evaluate the role of Shh pathway in tumor growth in immunodeficient mice.High-level expression of PTCH1 and Gli1 was detected in both NB samples and S-type NB cell lines.cyclopamine decreased the survival rate of the three cell lines while Shh increased it,and the inhibition effects of cyclopamine could be partially reversed by shh pre-treatment.cyclopamine induced the cell apoptosis and the cell cycle arrest in G0/G1 phase,while Shh induced the reverse effects and could partially prevent effects of cyclopamine.cyclopamine could also inhibit the growth of NB in vivo.Our studies revealed that activation of the Shh pathway is important for survival and proliferation of S-type NB cells in vivo and in vitro through affecting cell apoptosis and cell cycle,suggesting a new therapeutic approach to NB.

关键词： S-type neuroblastoma cell lines Sonic hedgehog signaling pathway cyclopamine

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cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响

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实用临床医药杂志 2010年第3期14卷 45-49页

作者：李润军郝晓蕊汤秀英张志耀孙志新张宏生佟明河北省秦皇岛港务集团有限公司港口医院泌尿外科河北秦皇岛066000 河北省秦皇岛市第一医院CCU 河北秦皇岛066000 辽宁医学院附属第一医院泌尿外科辽宁锦州121001

目的研究cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法体外培养的PC-3细胞应用cyclopamine处理后,通过MTT测定细胞增殖抑制情况;电镜下观察肿瘤组织形态学变化;流式细胞... 详细信息

目的研究cyclopamine对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法体外培养的PC-3细胞应用cyclopamine处理后,通过MTT测定细胞增殖抑制情况;电镜下观察肿瘤组织形态学变化;流式细胞仪检测凋亡率;Western印迹技术检测Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白的表达变化。结果MTT法结果显示4μmol/L,8μmol/L及12μmol/L浓度的cyclopamine对PC-3细胞增殖有显著抑制作用,与对照组相比差异有显著性(Pcyclopamine诱导PC-3细胞发生凋亡;Western印迹技术的结果:经培养72h后,随着药物浓度增大,Bcl-2蛋白表达呈逐渐减少,而Bax,有活性的caspase-9蛋白表达逐渐增多。结论cyclopamine抑制PC-3细胞增殖,在一定剂量和时间范围内呈时间、浓度依赖关系,并可诱导其凋亡。cyclopamine诱导PC-3细胞凋亡可能通过Bcl-2,Bax,caspase-9介导。

关键词： cyclopamine 前列腺癌细胞凋亡 PC-3细胞株 Bcl-2 Bax Caspase-9

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cyclopamine调控Hedgehog信号通路对正常角质形成细胞的影响

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中国美容医学 2006年第5期15卷 518-520,i0002页

作者：刘瑛李承新刘玉峰第四军医大学西京医院皮肤科陕西西安710032

目的:探讨cyclopamine抑制Hedgehog信号转导通路对角质形成细胞增殖的影响。方法:在培养的Hacat角质形成细胞中加入Hedgehog信号转导通路特异性抑制剂cyclopamine,在不同的作用时间,应用MTT和BrdU掺入的方法,检测cyclopamine对Hacat角... 详细信息

目的:探讨cyclopamine抑制Hedgehog信号转导通路对角质形成细胞增殖的影响。方法:在培养的Hacat角质形成细胞中加入Hedgehog信号转导通路特异性抑制剂cyclopamine,在不同的作用时间,应用MTT和BrdU掺入的方法,检测cyclopamine对Hacat角质形成细胞生长和增殖的影响。结果c:yclopamine可以抑制Hacat角质形成细胞的生长和增殖。结论:抑制Hedgehog信号转导通路可能对角质形成细胞增殖起到一定的抑制作用。

关键词： Hedgehog MTT BrdU cyclopamine 角质形成细胞

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Preparation and in vitro antitumor activities of triptolide and cyclopamine loaded polymeric micelles

Preparation and in vitro antitumor activities of triptolide ...

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2018年第十二届中国药物制剂大会

作者：刘德俊 Di Zhang Yixue Pei Yongjie Liu Lingyun Xu School of Biology and Pharmaceutical Engineering Wuhan Polytechnic University

Objective: In order to overcome the poor solubility of triptolide(TP) and cyclopamine(CPA), enhance their anticancer effects, and decrease their side effects, triptolide and cyclopamine encapsulated polymeric micelle system(TP/CPA-PM) was prepared and its in-vitro antitumor activities were investigated. Methods: Self-prepared PEG-PLC was used as a carrier material to prepare a novel polymeric micelle system containing both TP and CPA(TP/CPA-PM;TP:CPA = 1:1, w/w) using acetone solvent evaporation method. The micelles were characterized in terms of particle size, analyzed by laser particle size analyzer, entrapment efficiency, determined by high-performance liquid chromatography(HPLC), and in-vitro drug release, determined by combining dialysis method with HPLC. The MTS assay was performed at different time points to determine the inhibitory effect of TP/CPA-PM and free-TP/CPA with different concentrations on the proliferation of three kinds of human pancreatic carcinoma cell lines, namely Miapace-2 cells, Kras cells and HPSC cells. Results: The average particle size of TP/CPA-PM(TP:CPA = 1:1, w/w) was(54.3±2.6) nm(n = 3), and the encapsulation efficiency of TP and CPA was(48.7±7.7%)(n = 3) and(58.9±6.0%)(n = 3), respectively. The drug release curve showed that TP in TP/CPA-PM demonstrated fast-release profile, while CPA in TP/CPAPM indicated sustained-release profile. The release of CPA from micelles was faster at pH 5.2 than at pH 7.4. After 24 h of incubation at 37 °C, 39.0% of CPA was released at pH 7.4, while 58.4% was released at pH 5.2. Compared with free-TP/CPA, TP/CPA-PM significantly inhibited the proliferation of the three kinds of pancreatic cancer cells in a dose-dependent and time-dependent manner. Conclusion: These findings indicate that the combination of triptolid and cyclopamine loaded in polymeric micelles is an effective strategy to treat pancreatic tumors.

关键词： Triptolide cyclopamine polymer micelles encapsulation efficiency in-vitro release profile pancreatic cancer cells

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调控Smo活性对成年大鼠神经干细胞增殖和迁移的影响

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南方医科大学学报 2021年第10期41卷 1588-1592页

作者：仇欣霞陈荷冯德龙董为人南方医科大学基础医学院实验教学管理中心广东广州510515 南方医科大学第三附属医院神经外科广东广州510630 南方医科大学肿瘤研究所广东广州510515

目的探讨Shh信号通路中G蛋白偶联受体Smoothened(Smo)对成年大鼠神经干细胞(ANSCs)增殖、迁移的影响并阐明其作用机制。方法培养ANSCs,分别添加Smo的激动剂Purmorphamine及其抑制剂cyclopamine,细胞增殖-毒性实验(CCK8)检测其对ANSCs增... 详细信息

目的探讨Shh信号通路中G蛋白偶联受体Smoothened(Smo)对成年大鼠神经干细胞(ANSCs)增殖、迁移的影响并阐明其作用机制。方法培养ANSCs,分别添加Smo的激动剂Purmorphamine及其抑制剂cyclopamine,细胞增殖-毒性实验(CCK8)检测其对ANSCs增殖的影响;细胞划痕实验检测其对ANSCs迁移能力的影响;实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测Sonic Hedgehog(Shh)信号通路的细胞表面Patched蛋白(Ptch1)、G蛋白偶联受体Smo、转录因子(Gli1)以及神经导向因子(Slit1)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达量的变化。结果Smo激动剂PM对ANSCs的增殖有明显促进作用,48 h后PM组ANSCs的吸光度明显升高(P<0.01);PM可以促进ANSCs的迁移,48 h后的PM组ANSCs划痕面积显著减小(P<0.01);Smo抑制剂CPM对ANSCs的增殖和迁移均有显著的抑制作用;RT-PCR实验显示PM组细胞中的Ptch1、Smo、Gli1及Slit1、BDNF表达水平均明显增加(P<0.05)。结论调控Smo的活性可以促进或抑制成年神经干细胞的增殖和迁移,其作用机制可能与调节BDNF和Slit1的表达有关。

关键词： Purmorphamine cyclopamine G蛋白偶联受体Smoothened 成年神经干细胞

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Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells and Their Differentiation into Pdx-1<sup>+</sup>Cells

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Journal of Biomedical Science and Engineering 2015年第11期8卷 780-788页

作者： Mahmoud Hashemitabar Elham Allahbakhshi Mohamad Reza Tabande Mahmoud Orazizadeh Fereshteh Nejad Dehbashi Saeed Azandeh Kambiz Ahmadi Engali Darioush Bijan Nejad Department of Anatomical Science Faculty of Medicine Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences (AJUMS) Ahvaz Iran Cellular and Molecular Research Center (CMRC) Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences (AJUMS) Ahvaz Iran Depatment of Biology Faculty of Sciences Izeh Branch Islamic Azad University Izeh Iran Department of Basic Sciences School of Veterinary Medicine Shahid Chamran University Ahvaz Iran Department of Statistics and Epidemiology Faculty of Public Health Ahvaz Jundishapur University of Medical

Background: Recent studies have focused on generating of insulin-producing cells (IPCs) from pluripotent stem cells. Producing of precursor's population with pancreatic endoderm properties is a challenging issue in front of regenerative medicine investigators. Previous studies have shown that during pancrease development in lower portion of foregut, signals from notochord suppress sonic hedgehog (Shh) expression and lead to increase expression of pancreatic duodenal homeobox-1 (Pdx-1) as a marker for pancreatic precursor's cells. Therefore, Shh repression is considered as a critical step in IPCs generation protocols. Objective: Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUC-MSCs) is the aim of current study. As well as the role of basic fibroblast growth factor (bFGF) alone and in combination with cyclopamine are investigated in creating cells with Pdx-1 expression ability. Methods: Cells differentiate into definitive endoderm by adding activin A and wnt-3α into RPMI medium supplemented with for 3 days. At the second stage, the cells are washed with phosphate-buffered saline (PBS). One group (group A) is treated with bFGF for 5 days. Second group (group B) is treated with cyclopamine-KADD for 5 days. Third group (group C) is treated with bFGF and cyclopamine-KAAD for 5 days. Forth group (group D) is untreated as control. Result: Our results show that bFGF and cyclopamine in combination induce more expression of Pdx-1 in HUC-MSCs.

关键词： bFGF cyclopamine Pdx-1 Human Wharton’s Jelly

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Ptch和Smo在舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中的表达及其意义

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口腔医学研究 2015年第5期31卷 433-436页

作者：程志芬崔演玄延花南阳医学高等专科学校第一附属医院口腔科河南南阳473000 延边大学医学院病理学教研部延边大学附属医院肿瘤科

目的:研究Hedgehog(Hh)信号通路相关因子Ptch和Smo在舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中的表达及其意义。方法:Hh信号通路抑制剂cyclopamine处理Tca8113细胞后,采用MTT实验检测细胞增殖抑制率,再利用RT-PCR法和Western-Blot方法检测Ptch和Smo... 详细信息

目的:研究Hedgehog(Hh)信号通路相关因子Ptch和Smo在舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中的表达及其意义。方法:Hh信号通路抑制剂cyclopamine处理Tca8113细胞后,采用MTT实验检测细胞增殖抑制率,再利用RT-PCR法和Western-Blot方法检测Ptch和Smo的mRNA和蛋白表达情况。结果:cyclopamine对Tca8113细胞增殖具有抑制作用。加药后的不同时间段中,显示Ptch、Smo的mRNA和蛋白在cyclopamine药物组中的表达低于对照组。Smo的mRNA和蛋白分别在加药后24h、72h中的表达随着药物浓度增高而降低。结论:cyclopamine可以抑制Tca8113细胞的生长,降低Smo mRNA和蛋白的表达,Hh信号通路可能在舌癌的发生、发展中起重要作用。

关键词： Hh信号通路 Tca8113细胞 cyclopamine Ptch Smo

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Hedgehog信号转导途径对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡以及对CycinD1表达的影响

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重庆医科大学学报 2009年第1期34卷 45-48页

作者：黄伟张徽姜小良刘香丽重庆医科大学基础医学院病理学教研室重庆400016

目的:本实验通过Hedgehog(HH)信号转导途径的抑制剂cyclopamine作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞,研究Hedgehog信号转导途径对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡以及对CycinD1表达的影响。方法:以MDA-MB-231细胞为研究对象,应用cyclopamine... 详细信息

目的:本实验通过Hedgehog(HH)信号转导途径的抑制剂cyclopamine作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞,研究Hedgehog信号转导途径对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡以及对CycinD1表达的影响。方法:以MDA-MB-231细胞为研究对象,应用cyclopamine处理后,用MTT方法检测细胞增殖活性的改变;用流式细胞术检测细胞周期与凋亡的情况;RT-PCR检测GLI1、CyclinD1的mRNA的变化;用免疫细胞化学术检测细胞中的CyclinD1蛋白表达的变化。结果:与对照组相比,cyclopamine可显著抑制MDA-MB-231细胞的生长并呈时效-量效关系;流式细胞术检测MDA-MB-231细胞,发现cyclopamine能提高细胞周期G0/G1期的比例,48h后出现明显的"亚G1"峰;GLI1,CyclinD1的mRNA以及CyclinD1蛋白的表达降低。结论:乳腺癌MDA-MB-231细胞有Hedgehog信号转导途径的激活;Hedgehog信号转导途径的抑制剂cyclopamine能明显抑制MDA-MB-231细胞生长并能诱导其凋亡,减少CyclinD1的表达。

关键词： Hedgehog GLI1 CyclinD1 信号转导 cyclopamine

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Hedgehog在柚皮苷促进人牙周膜干细胞成骨分化中的机制研究

Hedgehog在柚皮苷促进人牙周膜干细胞成骨分化中的机制研究

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作者：周渊山东大学

学位级别：硕士

牙周组织包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质,其改建是正畸牙移动（orthodontic tooth movement,OTM）的生物学基础。很多研究证实,中药可以影响正畸牙移动进程,柚皮苷（Naringin）作为中药骨碎补的重要成分之一,大多来源于芸香科柑橘属... 详细信息

牙周组织包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质,其改建是正畸牙移动（orthodontic tooth movement,OTM）的生物学基础。很多研究证实,中药可以影响正畸牙移动进程,柚皮苷（Naringin）作为中药骨碎补的重要成分之一,大多来源于芸香科柑橘属植物的干燥果皮中,能够增强牙周膜细胞的增殖和成骨向分化能力。Hedgehog信号通路与骨的生长发育密切相关,Runx2在Hedgehog促进成骨细胞晚期分化过程中发挥重要作用,而柚皮苷可增强Runx2在体外培养的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）中的表达水平,因而我们推测,柚皮苷可以通过Hedgehog信号通路来促进正畸牙移动。目的:本研究将探讨柚皮苷是否可通过Hedgehog信号通路来促进牙周膜干细胞的成骨分化。方法:运用组织块培养法孵育原代人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）,取生长状态良好的第三代细胞行流式细胞术鉴定细胞干性;行成骨诱导分化实验和成脂诱导分化实验证实培养的细胞具有分化潜能;运用ALP定量法研究柚皮苷浓度与时间对牙周膜干细胞成骨分化的影响,从而确定最佳药物浓度与药物作用时间;将实验组分为柚皮苷组、柚皮苷+通道抑制剂组及空白对照组,运用RT-PCR和Western Blot对比各分组ALP、OCN、Runx2等成骨相关及SMO、Gli1、Ptch通道相关基因蛋白的表达量。结果:1.成功运用组织块培养法得到hPDLSCs,形态正常呈梭形或多角形,状态良好,流式细胞术显示其表面标记物CD44、CD90、CD105表达呈阳性,CD34、CD45表达呈阴性;成骨诱导茜素红染色阳性,有矿化结节形成;成脂诱导油红O染色阳性,有脂滴形成,说明细胞具有分化潜能。2.ALP定量法显示,柚皮苷作用7天,浓度为1mg/L为最佳药物作用时间及浓度。3.加入通道抑制剂cyclopamine后,成骨相关及通道相关基因及蛋白表达量降低,证明柚皮苷可通过Hedgehog信号通路促进hPDLSCs成骨分化,抑制Hedgehog信号通路可降低柚皮苷的促成骨作用。结论:1.柚皮苷对hPDLSCs的成骨分化有促进作用,ALP试验结果探索出最佳浓度与作用时间的关系。2.Hedgehog信号通路在hPDLSCs成骨分化中起调控作用。3.柚皮苷可通过Hedgehog信号通路促进hPDLSCs成骨分化。

关键词：柚皮苷 Hedgehog 成骨牙周膜干细胞 cyclopamine

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抑制Hedgehog信号通路对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖及凋亡的影响

抑制Hedgehog信号通路对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖及凋亡的影响

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作者：刘海燕第四军医大学

学位级别：硕士

皮肤鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)的发病率有逐年增高趋势,但其病因及具体发病机制尚未完全阐明,近年的资料表明可能与下列因素有关:1、紫外线辐射;2、人乳头瘤病毒(HPV);3、化学致癌物质的接触;4、癌前期皮肤病及免疫抑制... 详细信息

皮肤鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)的发病率有逐年增高趋势,但其病因及具体发病机制尚未完全阐明,近年的资料表明可能与下列因素有关:1、紫外线辐射;2、人乳头瘤病毒(HPV);3、化学致癌物质的接触;4、癌前期皮肤病及免疫抑制剂的应用;5、其他皮肤病:慢性溃疡、烧伤或外伤性瘢痕等;6、热损伤。目前SCC的治疗多为非特异性疗法,并不针对肿瘤自身的发病特点,所以不良反应较常见。因此,开发新型的、针对肿瘤特定发病机制的治疗更具前景,也引起国内外皮肤界学者的广泛关注。 Hedgehog(Hh)信号通路是近年来倍受关注的一个调控胚胎发育的信号转导途径。研究表明,Hh信号通路在基底细胞癌(Basal cell carcinoma,BCC)等多种肿瘤的发病及治疗中起着重要作用。cyclopamine(环杷明)是Hh通路的特异性抑制剂,它可以特异性抑制该通路的活性,已成为一种潜在的抗肿瘤药物。既往研究和我们的初步工作发现SCC的发生、发展与Hh通路的异常激活有关。为进一步明确Hh信号通路在SCC发病和治疗中的作用,本课题以五种人SCC细胞系为研究对象,体外观察cyclopamine特异性抑制Hh信号通路对SCC细胞增殖、凋亡及其细胞周期的影响。目的:探讨cyclopamine特异性抑制Hedgehog信号转导通路对人SCC细胞增殖及凋亡的影响。方法:体外培养五种人SCC细胞株,经cyclopamine处理后,分别采用MTT法测定cyclopamine对SCC细胞增殖的抑制作用,光镜下观察细胞形态变化,采用流式细胞仪PI染色法检测cyclopamine对SCC细胞周期分布的影响,并用流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双重标记法检测细胞凋亡的变化。结果: 1、cyclopamine抑制Hh通路对SCC细胞的形态学影响体外常规培养五种鳞癌细胞系A431、Sa3、HSQ-89、Tca、HSC-2,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长情况。五种细胞均呈贴壁生长,镜下观察结果显示:空白对照组和阴性对照组的细胞形态规则,轮廓清晰;与对照组细胞形态比较,cyclopamine组细胞生长缓慢,立体感消失,细胞内颗粒增多,胞质皱缩,核固缩现象明显,细胞变小变圆,轮廓变模糊。形态学结果表明cyclopamine作用后的各SCC细胞系生长受到抑制,形态受损。 2、cyclopamine对SCC细胞增殖的抑制作用 MTT比色法检测不同浓度(依次为:0.5、1、2、5μmol/L)cyclopamine对鳞癌细胞生长的剂量效应影响,结果表明cyclopamine能剂量依赖性地抑制五种鳞癌细胞的生长,其中以5μM浓度时抑制作用最为明显。选取5μM cyclopamine作用于培养的细胞5～8天,检测其抑制鳞癌细胞生长的时间效应。结果表明cyclopamine对各SCC细胞系的增殖抑制也具有时间依赖性。 3、cyclopamine对SCC细胞的凋亡诱导作用选取5μM cyclopamine作用于SCC细胞48h,采用Annexin-V-FITC/PI双重染色,流式细胞仪检测凋亡率的变化。结果显示,除HSQ-89细胞的凋亡率未检测到明显改变外,cyclopamine组的A431、Sa3、Tca、HSC-2四种细胞凋亡率(早期+晚期凋亡率)均较空白对照组明显增加(Pcyclopamine能够明显诱导SCC细胞发生凋亡,对不同的SCC细胞系,其凋亡诱导作用不同。 4、cyclopamine对SCC细胞的周期阻滞作用 5μM cyclopamine作用于SCC细胞48h,PI染色后流式细胞仪检测cyclopamine对SCC细胞周期分布的影响。结果显示:Tca细胞的实验组G/M期细胞较空白对照组明显增多,A431、Sa3、HSC-2三种细胞的实验组G/G期细胞较空白对照组明显增多,G1期前出现较对照组更为明显的亚二倍体峰;HSQ-89的细胞实验组与对照组未检测到明显差别。结果表明:cyclopamine抑制Hh通路能够影响SCC细胞的正常周期活动,它可诱导Tca细胞发生G/M期阻滞,诱导A431、Sa3、HSC-2细胞发生G0/G1期阻滞。结论:Hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine能够有效抑制SCC细胞的增殖,诱导细胞凋亡,诱导细胞发生特定细胞周期的阻滞为其可能机制之一。该结果为进一步深入研究SCC的发病机制及探索新的治疗方法提供了一定的理论依据。

关键词： Hedgehog信号通路 cyclopamine 鳞状细胞癌增殖凋亡

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