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Expression,Purification and Anti-tumor Activity of curcin

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2006年第9期38卷 663-668页

作者： Meng-Jun LUO~1 Xin-Yu YANG~1 Wei-Xin LIU~2 Ying XU~1 Ping HUANG~2 Fang YAN~1 Fang CHEN~1* 1 College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610041,China 2 Chengdu Institute for Family Planning,Chengdu 610031,China CollegeofLifeSciences SichuanUniversityChengdu610041China ChengduInstituteforFamilyPlanning Chengdu610031China

curcin,purified from the seeds of Jatropha curcas,can be used as a cell-killing *** the anti-tumor activity of the recombinant protein of curcin is important for its application inclinical *** segment encoding the mature protein of curcin was inserted into Escherichia colistrain M 15,and the recombinant strain was induced to express by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside at aconcentration of 0.5 *** recombinant protein was expressed in the form of inclusion bodies andpurified by Ni-NTA affinity *** target protein was incubated with the tumor cells atdifferent concentrations for different times and the results demonstrated that the target protein could inhibitthe growth of tumor cells (NCL-H446,SGC-7901 and S180) at 5μg/ml.

关键词： curcin expression purification recombinant protein anti-tumor activity

Cloning and Expression of curcin, a Ribosome-Inactivating Protein from the Seeds of Jatropha curcas

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Acta Botanica Sinica 2003年第7期45卷 858-863页

作者：林娟陈钰徐莺颜钫唐琳陈放四川大学生命科学学院成都610064

curcin, a ribosome-inactivating protein with a molecular weight of about 28.2 kD, which strongly inhibits the protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate system with an IC50 value of about (0.19 +/- 0.01) nmol/L, was purified from the seeds of Jatropha curcas L. The protein has the activity of rRNA N-glycosidase. Degenerate primers were designed based on the N-terminal partial sequence from purified curcin. The full-length curcin cDNA by RT-PCR and 5'-RACE was cloned. The deduced amino acids sequence indicates that a preprotein with 20 amino acid residues is first translated and then processed to a mature protein with 251 amino acids. The deduced amino acids sequence shares homology of 33% and 57% to those of type I ribosome-inactivating proteins (RIPs) and A chain of type II RIPs, respectively. The sequence encoding mature curcin was integrated into the pQE-30 vector for expression in Escherichia coli strain M15 (pREP4). The purified recombinant curcin was able to inhibit protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate system.

关键词： Jatropha curcas curcin RNA N-glycosidase cloning in Escherichia coli expression

一种提取土壤样品中麻疯树核糖体失活蛋白curcin的方法

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应用与环境生物学报 2017年第6期23卷 1129-1134页

作者：张杨雪蒋楠吉柔风舒苹银冉雨露陈放徐莺四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室能源植物生物燃油制备及利用国家地方联合工程中心成都610064

建立并优化了一种土壤麻疯树核糖体失活蛋白curcin的提取方法.优化后的提取步骤和参数为:0.1 g含curcin的土壤样品加入1 m L的提取缓冲液(5 mmol/L磷酸盐,0.1 mmol/L EDTA,0.2%SDS(m/V),20 mmol/Lβ-巯基乙醇,p H7.2),在18℃以上的室温... 详细信息

建立并优化了一种土壤麻疯树核糖体失活蛋白curcin的提取方法.优化后的提取步骤和参数为:0.1 g含curcin的土壤样品加入1 m L的提取缓冲液(5 mmol/L磷酸盐,0.1 mmol/L EDTA,0.2%SDS(m/V),20 mmol/Lβ-巯基乙醇,p H7.2),在18℃以上的室温条件下振荡混匀1 h,离心取上清液.重复该过程一次,合并上清液.上清液于4℃放置过夜,离心取上清液,即为样品粗提液.该样品粗提液即可用单克隆抗体间接酶联免疫吸附法(ELISA)进一步检测其中的curcin含量.该方法对curcin含量高于8μg/g土壤可进行定性检测,对于curcin含量分别为100、500、1 000μg/g的土壤样品的回收率分别达到49.3%±2.8%、64.2%±3.62%和78.33%±4.24%.该方法的变异系数保持在5%左右,对来自四川3个样地的土壤有较好的适用性.本研究建立优化的提取方法可为评估curcin蛋白在农业领域应用的生态风险提供技术支持.

关键词：土壤核糖体失活蛋白 curcin 麻疯树提取方法

麻疯树逆境蛋白(curcin 2)基因的原核表达

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四川大学学报（自然科学版） 2006年第1期43卷 206-211页

作者：魏琴张新申黄明星徐莺王胜华陈放四川大学生命科学学院成都610064 四川大学轻纺与食品学院博士后流动站成都610064

将编码麻疯树逆境蛋白curcin 2成熟蛋白的M片段和编码前体蛋白的P片段分别定向克隆到质粒载体pQE-30、pQE-31后,获得重组质粒pQE-30-M、pQE-31-P.该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,经IPTG诱导后M片段表达的蛋白质主要以包涵体形式存在,蛋... 详细信息

将编码麻疯树逆境蛋白curcin 2成熟蛋白的M片段和编码前体蛋白的P片段分别定向克隆到质粒载体pQE-30、pQE-31后,获得重组质粒pQE-30-M、pQE-31-P.该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,经IPTG诱导后M片段表达的蛋白质主要以包涵体形式存在,蛋白质的表达量与IPTG浓度及诱导时间有关.重组蛋白可与RGS-His抗体及curcin抗体分别发生专一性抗原抗体反应并被His TrapTMHP柱亲和纯化.体外抗真菌活性实验表明,复性处理后的curcin 2融合蛋白使玉米弯胞杆菌[Curvularia lunata(Walk)Boed]的菌丝生长受到一定程度的抑制.所有检测表明P片段未在M15中表达.以上实验结果为该信号肽的功能研究及curcin 2基因及其蛋白在农业生产上的研究和应用提供实验基础.

关键词：麻疯树 curcin 2基因原核表达信号肽

麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析

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植物学通报 2008年第4期25卷 407-414页

作者：秦小波高继海徐莺张金平邵彩霞林莎张淑文江璐玎李月琴陈放四川大学生命科学学院成都610064

核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守α茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白(curcin)前体基因编码麻疯树胚乳I型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5'侧翼区0.6 kb长的片段,将该片段插入pBI121载体置换其中的C... 详细信息

核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守α茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白(curcin)前体基因编码麻疯树胚乳I型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5'侧翼区0.6 kb长的片段,将该片段插入pBI121载体置换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现,该0.6 kb长的片段能够启动报告基因在种子中的表达,并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时,GUS组织化学染色定位分析表明,在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的,它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。

关键词： curcin 麻疯树启动子核糖体失活蛋白

麻疯树核糖体失活蛋白curcin基因的原核表达及其抗真菌活性的研究

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四川大学学报（自然科学版） 2009年第6期46卷 1793-1797页

作者：邵彩霞秦小波蔡峰辜小平闫毅武王成世徐莺陈放 Cai-Xia Xiao-Bo Xiao-Ping Yi-Wu Cheng-Shi 四川大学生命科学学院成都610064

通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达... 详细信息

通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达.然后通过纯化原核表达产物,得到纯化的curcin重组蛋白,并以纸片法进行体外抗菌活性检测,发现其具有较强抗真菌活性.

关键词：麻疯树核糖体失活蛋白 curcin 基因片段原核表达载体抗真菌活性 antibacterial activity expression vector 重组蛋白转化大肠杆菌 Jatropha curcas gene fragments 开放阅读框重组质粒体外抗菌活性检测纯化表达产物 IPTG诱导 in vitro reading

两种麻疯树核糖体失活蛋白基因curcin和curcin C在种子萌发过程中的表达模式研究

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四川大学学报（自然科学版） 2021年第1期58卷 149-153页

作者：张敬吉柔风杨千丁蒙蒙陈放徐莺四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610065

为了研究和开发丰富的麻疯树资源,本研究以四川省西昌市金沙江干热河谷地区的麻疯树种子为材料,将种子浸水萌发后收集各组织用于实验.qRT-PCR结果显示胚乳中curcin、curcin C基因表达先增加后减少,在子叶中curcin C基因的表达也是如此.W... 详细信息

为了研究和开发丰富的麻疯树资源,本研究以四川省西昌市金沙江干热河谷地区的麻疯树种子为材料,将种子浸水萌发后收集各组织用于实验.qRT-PCR结果显示胚乳中curcin、curcin C基因表达先增加后减少,在子叶中curcin C基因的表达也是如此.Western Blot结果显示curcin蛋白在根、下胚轴、真叶、子叶中不表达,curcin C蛋白在根和下胚轴中也不表达,而在真叶、子叶中表达.生物信息学软件预测及亚细胞定位结果都显示curcin:GFP和curcin C:GFP融合蛋白定位在细胞壁上.本研究初步阐明了两种麻疯树核糖体失活蛋白curcin、curcin C的表达模式并对其进行了亚细胞定位.

关键词：麻疯树 curcin curcin C 基因表达模式

促进curcin-TfRBP9融合蛋白可溶性表达研究

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促进curcin-TfRBP9融合蛋白可溶性表达研究

作者：贾长增暨南大学

学位级别：硕士

目的:麻疯树毒蛋白-转铁蛋白受体结合肽(curcin-TfRBP9)融合蛋白在原核表达系统中以包涵体形式表达,且复性较为困难。本论文通过采用类弹性蛋白表达系统及小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)等途径,构建多种重组表达载体,探讨其对实现curcin-Tf... 详细信息

目的:麻疯树毒蛋白-转铁蛋白受体结合肽(curcin-TfRBP9)融合蛋白在原核表达系统中以包涵体形式表达,且复性较为困难。本论文通过采用类弹性蛋白表达系统及小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)等途径,构建多种重组表达载体,探讨其对实现curcin-TfRBP9融合蛋白可溶性表达的可行性,为实现规模化制备curcin-TfRBP9蛋白提供高效的表达纯化工艺,为麻风树毒蛋白(curcin)的研究与应用打下一个基础。方法:1.采用PCR技术分别扩增curcin和curcin-TfRBP9基因,经限制性内切酶消化及连接,将curcin和curcin-TfRBP9基因分别克隆到类弹性蛋白表达载体pET-ELP-Intein,构建重组表达载体pET-ELP-Intein-curcin和pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9。2.重组表达载体pET-ELP-Intein-curcin和pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9转化表达菌株*** BLR(DE3);菌落PCR筛选重组子,DNA测序鉴定。***(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin,BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9经低温渗透表达及可逆相变循环(ITC),纯化分析curcin和curcin-TfRBP9蛋白的可溶性表达。4.构建pQE-30-sumo-curcin-TfRBP9,pQE-30-GST-sumo-curcin-TfRBP9表达载体,分别转化表达菌株*** M15,菌落PCR鉴定,诱导表达,筛选重组子,基因测序分析。重组子经IPTG低温诱导表达分析融合蛋白可溶性表达。5.融合蛋白GST-sumo-curcin-TfRBP9经Glutathione Sepharose 4B柱,sumo特异性酶消化,CM SepharoseTM Fast Flow纯化后,MTT检测curcin-TfRBP9蛋白对肿瘤细胞的抑制作用。结果:含有表达质粒的菌株BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin,BLR(DE3)/pET-ELP-Intein-curcin-TfRBP9在TB培养基中培养,在OD600=0.6-0.8时,将菌体的培养条件转变为18℃220rpm低温渗透表达融合蛋白,经基于类弹性蛋白的可逆相变循环(ITC)纯化,及12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析,未发现curcin和curcin-TfRBP9蛋白的可溶性表达。两株含有不同重组质粒的菌株*** M15/pQE-30-sumo-curcin-TfRBP9,*** M15/pQE-30-GST-sumo-curcin-TfRBP9在LB培养基中经1mmol IPTG终浓度在低温诱导表达,表达产物的上清和沉淀经12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析,sumo-curcin-TfRBP9融合蛋白主要以包涵体的形式表达,而GST-sumo-curcin-TfRBP9融合蛋白显示很强的可溶性表达。在30℃是的可溶性比例可以占目的蛋白的55%以上。融合蛋白GST-sumo-curcin-TfRBP9经Glutathione Sepharose 4B柱,sumo特异性酶消化,CM SepharoseTM Fast Flow纯化后,可溶性的curcin-TfRBP9融合蛋白被收获,MTT实验结果显示,同剂量浓度时curcin-TfRBP9与curcin相比,对高表达TfR的A549细胞有着显著抑制作用,而在对LO-2细胞的抑制率上没有显著差异。相比LO-2细胞curcin-TfRBP9对A549细胞有更强的抑制作用。结论:使用类弹性蛋白表达系统和单独使用sumo标签系统未发现促进curcin-TfRBP9的可溶性表达,而GST和SUMO标签联合应用可显著促进curcin-TfRBP9的可溶性表达;融合蛋白GST-sumo-curcin-Tf RBP9经酶切消化和纯化后,可溶性curcin-TfRBP9蛋白被收获;curcin-TfRBP9对TfR高表达的肿瘤细胞的抑制作用与curcin相比有显著差异。

关键词：可溶性表达 curcin 转铁蛋白受体结合肽类弹性蛋白 S-谷胱甘肽转移酶小分子泛素样修饰蛋白 A549细胞

温度、酸碱度和盐离子浓度对curcin紫外光谱和荧光光谱的影响

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资源开发与市场 2014年第12期30卷 1409-1412页

作者：晏华立蒋楠樊佳黄曌徐莺陈放四川大学生命科学学院四川成都610065

将麻疯树核糖体失活蛋白curcin在不同温度、酸碱度和Na Cl浓度下进行孵育,测定其紫外光谱和荧光光谱的变化,对影响其结构稳定性的因素进行初步探究。研究结果显示,curcin对温度和p H变化相对敏感。当温度上升到70℃后,紫外吸收明显增加,... 详细信息

将麻疯树核糖体失活蛋白curcin在不同温度、酸碱度和Na Cl浓度下进行孵育,测定其紫外光谱和荧光光谱的变化,对影响其结构稳定性的因素进行初步探究。研究结果显示,curcin对温度和p H变化相对敏感。当温度上升到70℃后,紫外吸收明显增加,在348nm时新增一个明显的荧光激发峰。极端p H值对curcin结构影响同样较大,特别是当p H值为11时,在348nm处新增荧光激发峰。上述现象表明,温度和酸碱度的改变可能导致curcin中含色氨酸的疏水核心结构出现暴露在外的变性过程。curcin对上述两个因素的敏感性提示其稳定性还有待提高,才能满足蛋白质药物开发的需求。

关键词：麻疯树核糖体失活蛋白 curcin 紫外光谱荧光光谱