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我国亚洲玉米螟对cry1ie和cry1Ah敏感基线和cry1Ah诊断剂量的初步研究及其越冬幼虫主要天敌的调查

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我国亚洲玉米螟对Cry1Ie和Cry1Ah敏感基线和Cry1Ah诊断剂量的初步...

作者：段小莉四川农业大学

学位级别：硕士

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是危害玉米造成减产和引起品质下降的主要害虫之一。转基因抗虫玉米为其治理提供了简单有效的防治措施。靶标害虫的抗性治理是转基因作物可持续应用的重要保障。有效及时的抗性检测和监测是抗性... 详细信息

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是危害玉米造成减产和引起品质下降的主要害虫之一。转基因抗虫玉米为其治理提供了简单有效的防治措施。靶标害虫的抗性治理是转基因作物可持续应用的重要保障。有效及时的抗性检测和监测是抗性治理的重要内容。本实验通过调查我国玉米主要产区亚洲玉米螟越冬代幼虫自然死亡情况,了解田间苏云金芽胞杆菌等的感染率;建立转基因玉米生产应用前亚洲玉米螟对cry1ie和cry1Ah蛋白的敏感基线,得到cry1Ah蛋白的诊断剂量,从而为今后田间抗性监测提供科学依据。通过测定Bt蛋白cry1ie和cry1Ah毒素对15个地理种群亚洲玉米螟的毒力,明确了各地理种群之间致死中浓度变化范围分别为0.18 μg/g-3.42 μg/g和0.34 μg/g～3.87 μg/g不同地理种群之间差异显著。生长抑制中浓度分别为0.07 μg/g ～1.04 μg/g和0.08 μg/g～0.64 μg/g。因为采集年份上的差别,两者之间的变化亦不同,但在区域分布上敏感性较为相似,均为黄淮海区域亚洲玉米螟对cry1ie和cry1Ah的敏感性低,其次为东北春玉米区。2012年夏季采集的亚洲玉米螟种群较2012秋冬年采集的种群的LC5o显著较高。这说明亚洲玉米螟不同地理种群对cry1I和cry1Ah的敏感性存在显著差异,总的趋势是春玉米区种群较夏玉米区种群敏感,同时不同时间采集的种群间亦有显著差异。通过测定7个地理种群亚洲玉米螟对crylAh的毒力,初步确定了诊断剂量为60μg/g,为之后进一步测定田间的抗性频率提供基础。在2011年和2012年秋季采集14个省,20个点共计14984头玉米螟越冬幼虫。经调查各地越冬幼虫平均感染苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)和白僵菌(Beauveria bassiana)的死亡率分别为36.2%和14.4%。Bt和白僵菌的感染率在东北春玉米区年度间有波动,而在夏玉米及其它玉米产区,Bt感染率显著高于白僵菌。腰带长体茧蜂(Macrocentrus cingulum)和玉米螟厉寄蝇(Lydella grisescens)在各地普遍分布,为优势寄生性天敌昆虫,寄生致死率分别为7.0%和5.1%。大螟钝唇姬蜂(Eriborus terebranus)仅在北方春玉米区和夏玉米区的少数地区发生,且寄生率<1.0%。与天敌昆虫寄生死亡率相比,感染病原菌的死亡率显著较高,为主要致死因子,其中Bt所占比例较重,但年度间波动较大。

关键词：亚洲玉米螟 cry1ie cry1Ah 敏感基线诊断剂量越冬幼虫天敌

复合Bt cry1Ac和cry1ie抗虫玉米抗螟性及其在IRM中的作用

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复合Bt cry1Ac和cry1Ie抗虫玉米抗螟性及其在IRM中的作用

作者：江帆中国农业科学院

学位级别：硕士

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是我国玉米上的重要害虫之一。分子生物学的发展与基因工程技术的应用,使能够高效控制靶标害虫的Bt作物得到推广。但大面积种植转单一Bt基因作物可引发靶标害虫产生抗性,避免和延缓抗性是保障转... 详细信息

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是我国玉米上的重要害虫之一。分子生物学的发展与基因工程技术的应用,使能够高效控制靶标害虫的Bt作物得到推广。但大面积种植转单一Bt基因作物可引发靶标害虫产生抗性,避免和延缓抗性是保障转基因抗虫作物持续应用所面临的一项巨大挑战。“多基因”策略能有效延缓抗性产生,且更适宜于小农户种植模式,但要求所表达的毒素间不存在交互抗性或交互抗性很低。本研究通过田间抗螟性鉴定、组织生测、Elisa等方法,系统评价了cry1Ac/cry1ie双价抗虫基因玉米组织蛋白表达量,田间抗虫效果,室内对于亚洲玉米螟敏感品系ACB-BtS和以cry1Ac、cry1ie、cry1F分别连续筛选多代的抗性品系ACB-AcR、ACB-ieR、ACB-FR的杀虫活性及其在抗性治理中的应用潜力,并结合不同配比的蛋白浓度毒力生测,模拟蛋白在组织中的表达,探索其功能和规律,以期为抗性治理和新基因的挖掘及应用提供依据。另外将同样具有我国自主知识产权的转有耐除草剂epsps基因和Bt cry1Ac基因的双抗玉米进行对除草剂耐受性及目标蛋白表达量的研究。获得的主要结论如下:心叶期接虫后转基因玉米的食叶级别1-2级,而对照5-8级,差异显著。转基因玉米平均每株活虫数ie R在转单价cry1ie基因的玉米中死亡率较低,ACB-AcR在转单价cry1Ac基因的玉米中死亡率较低,ACB-FR在转单价cry1Ac基因的玉米中死亡率也较低,这可能是由于cry1F毒素和cry1Ac毒素具有一定的交互抗性,而这几个抗性种群在转双价基因的玉米中死亡率都较高,与敏感种群相近,说明转复合基因玉米对抗性种群有较好的杀虫效果。蛋白毒力生测表明,cry1Ac和cry1ie在浓度配比为1:5时对ACB-AcR不具增效作用。对草甘膦的耐受性实验表明,转复合基因玉米CC-2×BT799与单抗草甘膦品种CC-2对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐施用剂量中量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。Elisa检测显示,CP4 EPSPS蛋白在雄穗中的表达较叶片稍高。且双抗品种较CC-2中的CP4 EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中,BT799的cry1Ac蛋白含量与CC-2×BT799相当。在叶片中,Bt799的cry1Ac蛋白含量约为CC-2×Bt799的2倍。抗虫耐除草剂玉米能够有效抵御草甘膦的喷施,cry1Ac蛋白含量在不同品种不同组织中存在差异。结果表明,4种转基因玉米都具有较好的抗虫效果。不同组织而言,花丝的抗虫效果较差。蛋白毒力生测表明不同配比对不同抗性品系具有或强或弱的增效作用。在亚洲玉米螟敏感品系中,cry1Ac和cry1ie毒素配比为5:1时效果最佳,说明二者的结合更有利于靶标害虫的防治。对草甘膦的耐受性实验表明,转复合基因玉米CC-2×BT799与单抗草甘膦品种CC-2对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦正常剂量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。

关键词：亚洲玉米螟 Bt 生物技术玉米基因叠加 Elisa cry1Ac cry1ie

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1ie定向进化的研究

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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ie定向进化的研究

作者：刘明东北农业大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是,cry蛋白杀虫谱窄、毒力有限,以及害虫对Bt毒素的抗性风险上升等诸多弱点和因素将严重制约Bt在未... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是,cry蛋白杀虫谱窄、毒力有限,以及害虫对Bt毒素的抗性风险上升等诸多弱点和因素将严重制约Bt在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。但是,继续从自然界中分离克隆得到对害虫具有高毒力的新型Bt cry基因难度不断增加。因此,通过分子设计、蛋白质工程等新的技术对现有的cry毒素进行改造、使之发挥更大的作用是不少研发单位的新的研究目标。本论文围绕建立一种可控突变率的随机突变文库的方法、苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1ie的定向进化等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:将cry1Ac基因启动子与cry1ie基因通过重叠引物PCR的方法连接在一起,构建cry1ie基因在E. coli JM109中的表达载体。本方法是在建立随机突变文库的过程中,依据Taq DNA聚合酶在合成碱基时的固有误差和突变特性,结合cry毒素定向进化过程中需要的碱基突变数目,计算得到产生预期碱基突变所需PCR循环数。同时,本研究采用了荧光定量PCR监测PCR过程中DNA扩增来控制Taq DNA聚合酶的聚合反应的次数。在本实验中,以对小菜蛾(Plutella xylostella)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)有杀虫活性的cry1ie为材料,建立3个不同碱基替换率的随机突变文库,文库I、II、III中的每个DNA分子的预期碱基替换个数分别为1个、2个和3个。从3个文库中分别随机挑取100个克隆进行序列测定分析,结果表明,突变的碱基位点在cry1ie中随机均匀分布;文库I、II、III突变的单克隆数分别为59个、93个和98个;无义突变的克隆数分别为36个、43个、50个,错义突变的克隆数分别为13个、41个、38个;平均碱基替换个数为0.86个、2.1个、2.79个。综合以上结果发现,本研究设计的方法可以很好控制突变文库的碱基突变率,预期突变2个碱基的文库最适合用作cry毒素的定向进化。建立随机突变文库之后,进一步用小菜蛾进行生物活性的测定。测试了92个错义突变的突变株,结果表明与未突变的cry1ie(LC50为1.96252μg/ml)相比活性升高的有11株,其LC50分别是0.20470、0.81601、0.15063、0.44387、0.61911、0.49740、0.29259、0.51284、0.58315、0.29723、0.67218μg/ml,氨基酸的变化分别是Y162H&E181K,N214S、V236A、K237R、Y239H&A307V、N258Y、I285T&R506G、P320H&Y599N、Y422H、I507V、A522V,这些突变位点分布在cry1ie的三个结构域中,其中活性提高最明显是的位于结构域II中的双突变体Y239H&A307V,提高了13倍。研究结果显示,本研究所设计的定向进化方法适合cry毒素的定向进化,并开发一种简单的可控突变率的随机突变文库建立方法;同时本项研究采用了我国主知识产权的cry1ie基因为实验材料,并筛选到了11株对小菜蛾活性提高的突变体,这也为我国转Bt基因植物提供了新的材料。

关键词：苏云金芽胞杆菌 cry1ie 预期突变率随机突变文库定向进化

苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白cry1le和亚洲玉米螟围食膜结合机理的研究

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苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Cry1le和亚洲玉米螟围食膜结合机理的研究

作者：冯冬梅北京理工大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可以在其芽胞形成时期产生特异性很强的杀虫晶体蛋白。cry1ie基因在苏云金芽胞杆菌中由于其上游存在转录终止子而沉默不表达，将该基因克隆于大肠杆菌中可表达由719个氨基酸组成的cry1ie... 详细信息

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可以在其芽胞形成时期产生特异性很强的杀虫晶体蛋白。cry1ie基因在苏云金芽胞杆菌中由于其上游存在转录终止子而沉默不表达，将该基因克隆于大肠杆菌中可表达由719个氨基酸组成的cry1ie蛋白，对小菜蛾(Plutella xylostella)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorel)具有较高的杀虫活性。克隆并表达于大肠杆菌的ie648蛋白对应于cry1ie蛋白N-端的648个氨基酸残基，相比于全长蛋白具有更高的杀虫活性。cry蛋白通过与昆虫中肠上皮上的受体结合发挥毒性，围食膜是cry毒素在与中肠作用之前必须穿过的一层重要的半透性保护屏障，主要由几丁质和蛋白质组成。本论文主要围食膜的组成出发，从蛋白质和几丁质结合两个方面，研究了cry1ie蛋白与昆虫围食膜的结合。从围食膜整体出发，本研究组前期竞争性结合研究结果表明ie648及cry1ie蛋白结构域Ⅲ都能与亚洲玉米螟围食膜发生结合，但是结构域II由于表达为沉淀没有确定其在结合中的作用。本论文通过包涵体溶解复性的方法将结构域II溶解并通过亲和层析进行纯化，竞争性结合实验结果表明结构域II能够与ie648竞争结合围食膜。同时，通过合成肽段的竞争性结合实验研究了保守肽段、部分非保守肽段、在与中肠结合中发挥作用的特殊肽段以及结构域Ⅲ的loop区肽段在与昆虫围食膜结合中的作用，实验结果显示结构域Ⅲ的loop区L8肽段能够与ie648竞争围食膜的结合位点，其余大部分肽段不能够竞争围食膜上的作用靶点。在蛋白质结合方面，结构域Ⅱ与玉米螟围食膜的体外结合印迹实验显示它也可以与围食膜蛋白发生结合,与之结合的围食膜蛋白分子量大小在25-35kDa之间，情况与ie648及结构域Ⅲ吻合，但结合条带较为单一。牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，BSA）与玉米螟围食膜的体外结合印迹实验表明BSA也可与之发生结合，但仔细分析发现与BSA结合的围食膜蛋白和与cry蛋白结合的围食膜蛋白分子量大小差异显著。表明外源蛋白与围食膜蛋白的结合存在特异和非特异性结合，且结合位点不同。在几丁质结合方面，本论文通过体外结合实验，发现ie648及cry1ie蛋白的三个结构域都能够与不溶于水的几丁质发生结合，对cry蛋白与几丁质结合的研究并未见文献报导过，本研究尚属首次。通过基于氨基酸序列的活性位点预测、结构预测、空间结构比对等信息学分析方法研究了三个结构域和围食膜结合的结构基础，分析结果印证了结构域Ⅱ和结构域Ⅲ可能参与糖结合作用，但其具体作用机制和特异性还需要进一步实验研究。

关键词：苏云金芽胞杆菌 cry1ie 亚洲玉米螟围食膜结构域肽段