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农杆菌介导甜高粱转Bt cry1ah的研究

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中国农业科学 2011年第10期44卷 1989-1996页

作者：朱莉郎志宏李桂英何康来岳同卿张杰黄大昉中国农业科学院生物技术研究所中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/生物质能源研究中心中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室

【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1ah导入2个甜... 详细信息

【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1ah导入2个甜高粱品种"BABUSH"和"MN-3025"中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng.g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng.g-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng.g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。

关键词：甜高粱 cry1ah 农杆菌转化抗虫性

cry1Ab/cry1ah杂合蛋白构建与功能研究

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生物技术通报 2015年第9期31卷 91-96页

作者：徐曼蒋健束长龙张杰宋福平东北农业大学哈尔滨150030 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害国家重点实验室北京100193

cry1A类杀虫蛋白是目前应用最为广泛的杀虫蛋白,目前已经报道的cry1A类杀虫蛋白之间存在普遍的结构域交换现象。针对鳞翅目害虫具有高活性的cry1Ab与cry1ah蛋白开展研究,构建了cry1Ab、cry1ah的杂合蛋白ahahAb并测定了杀虫活性。结果显... 详细信息

cry1A类杀虫蛋白是目前应用最为广泛的杀虫蛋白,目前已经报道的cry1A类杀虫蛋白之间存在普遍的结构域交换现象。针对鳞翅目害虫具有高活性的cry1Ab与cry1ah蛋白开展研究,构建了cry1Ab、cry1ah的杂合蛋白ahahAb并测定了杀虫活性。结果显示,cry1Ab、cry1ah的结构域交换引起蛋白杀虫活性的显著变化,与出发蛋白相比,杂合蛋白ahahAb丧失了对棉铃虫杀虫活性,降低了对玉米螟、小菜蛾杀虫活性。利用生物信息学方法对cry1ah结构域I建模,并分析其与其他cry1A蛋白结构及表面性质差异,分析表明cry1ah与cry1Ab的结构域I有相同的碳骨架和二级结构,但是表面电势分布有较大差异。进一步分析杂合蛋白ahahAb与cry1Ab、cry1ah之间杀虫活性差异的原因对进一步揭示cry1A类蛋白杀虫特异性进化规律有重要意义。

关键词： cry1ah 结构域I 杀虫活性

我国亚洲玉米螟对cry1Ie和cry1ah敏感基线和cry1ah诊断剂量的初步研究及其越冬幼虫主要天敌的调查

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我国亚洲玉米螟对Cry1Ie和Cry1Ah敏感基线和Cry1Ah诊断剂量的初步...

作者：段小莉四川农业大学

学位级别：硕士

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是危害玉米造成减产和引起品质下降的主要害虫之一。转基因抗虫玉米为其治理提供了简单有效的防治措施。靶标害虫的抗性治理是转基因作物可持续应用的重要保障。有效及时的抗性检测和监测是抗性... 详细信息

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是危害玉米造成减产和引起品质下降的主要害虫之一。转基因抗虫玉米为其治理提供了简单有效的防治措施。靶标害虫的抗性治理是转基因作物可持续应用的重要保障。有效及时的抗性检测和监测是抗性治理的重要内容。本实验通过调查我国玉米主要产区亚洲玉米螟越冬代幼虫自然死亡情况,了解田间苏云金芽胞杆菌等的感染率;建立转基因玉米生产应用前亚洲玉米螟对cry1Ie和cry1ah蛋白的敏感基线,得到cry1ah蛋白的诊断剂量,从而为今后田间抗性监测提供科学依据。通过测定Bt蛋白cry1Ie和cry1ah毒素对15个地理种群亚洲玉米螟的毒力,明确了各地理种群之间致死中浓度变化范围分别为0.18 μg/g-3.42 μg/g和0.34 μg/g～3.87 μg/g不同地理种群之间差异显著。生长抑制中浓度分别为0.07 μg/g ～1.04 μg/g和0.08 μg/g～0.64 μg/g。因为采集年份上的差别,两者之间的变化亦不同,但在区域分布上敏感性较为相似,均为黄淮海区域亚洲玉米螟对cry1Ie和cry1ah的敏感性低,其次为东北春玉米区。2012年夏季采集的亚洲玉米螟种群较2012秋冬年采集的种群的LC5o显著较高。这说明亚洲玉米螟不同地理种群对cry1I和cry1ah的敏感性存在显著差异,总的趋势是春玉米区种群较夏玉米区种群敏感,同时不同时间采集的种群间亦有显著差异。通过测定7个地理种群亚洲玉米螟对crylah的毒力,初步确定了诊断剂量为60μg/g,为之后进一步测定田间的抗性频率提供基础。在2011年和2012年秋季采集14个省,20个点共计14984头玉米螟越冬幼虫。经调查各地越冬幼虫平均感染苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)和白僵菌(Beauveria bassiana)的死亡率分别为36.2%和14.4%。Bt和白僵菌的感染率在东北春玉米区年度间有波动,而在夏玉米及其它玉米产区,Bt感染率显著高于白僵菌。腰带长体茧蜂(Macrocentrus cingulum)和玉米螟厉寄蝇(Lydella grisescens)在各地普遍分布,为优势寄生性天敌昆虫,寄生致死率分别为7.0%和5.1%。大螟钝唇姬蜂(Eriborus terebranus)仅在北方春玉米区和夏玉米区的少数地区发生,且寄生率<1.0%。与天敌昆虫寄生死亡率相比,感染病原菌的死亡率显著较高,为主要致死因子,其中Bt所占比例较重,但年度间波动较大。

关键词：亚洲玉米螟 cry1Ie cry1ah 敏感基线诊断剂量越冬幼虫天敌

转Bt cry1ah基因抗虫玉米田间试验及遗传稳定性分析

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转Bt cry1Ah基因抗虫玉米田间试验及遗传稳定性分析

作者：崔浩然中国农业科学院

学位级别：硕士

随着生物技术的迅速发展，基因工程在作物新品种培育中已广泛应用，并取得了很多突破性的成果。利用基因工程手段获得有新性状的转基因植株，通过各种分子检测手段对外源基因的遗传稳定性进行检测，结合常规育种手段对现有作物品种进行... 详细信息

随着生物技术的迅速发展，基因工程在作物新品种培育中已广泛应用，并取得了很多突破性的成果。利用基因工程手段获得有新性状的转基因植株，通过各种分子检测手段对外源基因的遗传稳定性进行检测，结合常规育种手段对现有作物品种进行改良，从而实现转基因植株走向产业化。本课题对利用花粉管通道法获得的转cry1ah基因抗虫玉米高代自交系（PXH1和PXH2）以及利用基因枪法获得的转Bt cry1ah基因抗虫玉米（HF）进行分析，通过分子检测和田间玉米螟抗性试验，分析外源基因cry1ah在转基因玉米中的遗传稳定性，利用回交转育对获得的高抗转基因玉米株系与有优良农艺性状的自交系郑58进行回交，并且对回交后代进行分子跟踪检测和田间玉米螟抗抗性鉴定，得到的结果如下：（1）Bt cry1ah基因可以在PXH1和PXH2转基因玉米中逐代稳定遗传，在T11代达到纯合，通过Southern blot证明cry1ah基因分别以单拷贝（PXH1）和双拷贝（PXH2）的形式整合。（2）Bt cry1ah基因可以在HF转基因玉米中逐代稳定遗传，在T5代阳性率达到90.75%，接近纯合。（3）利用回交转育手段，分别获得回交F*1代（PXH1和PXH2）和BC2F1代（HF）种子，通过对各世代的cry1ah蛋白表达量和田间玉米螟抗性进行分析，发现两种指标均比供体亲本高。（4）通过荒地竞争实验，结果表明转基因玉米的生存竞争能力要远远小于杂草，不会影响环境中的物种多样性。

关键词：转基因玉米遗传稳定性 cry1ah 基因农艺性状生存竞争能力回交转育

转Bt基因抗虫玉米HGK60的农艺性状分析

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生物技术通报 2018年第7期34卷 92-100页

作者：梁海生李梦桃李圣彦汪海张杰郎志宏西南科技大学生命科学与工程学院绵阳621010 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

为了确定转Bt cry1ah抗虫玉米HGK60的自交系及其杂交后代外源基因的遗传表达稳定性和农艺性状,通过实时荧光定量PCR和ELISA分析外源基因的遗传表达稳定性,通过室内外生测和田间性状考量分析农艺性状。荧光定量PCR结果表明Bt cry1ah基因... 详细信息

为了确定转Bt cry1ah抗虫玉米HGK60的自交系及其杂交后代外源基因的遗传表达稳定性和农艺性状,通过实时荧光定量PCR和ELISA分析外源基因的遗传表达稳定性,通过室内外生测和田间性状考量分析农艺性状。荧光定量PCR结果表明Bt cry1ah基因在玉米的不同组织中可以正常转录,但RNA表达水平存在一定的差异;ELISA结果表明在转基因植株的不同发育时期、不同器官中cry1ah的蛋白表达量顺序:雄穗>叶片>苞叶>籽粒>花丝>穗轴。两地连续三代的田间及室内抗虫性检测结果表明HGK60抗虫玉米对亚洲玉米螟均表现出很好的抗性。性状考量结果表明HGK60抗虫玉米与受体材料对照比较,种子发芽率、生育期、穗行数、穗长、千粒重等农艺性状均无显著差异。通过多年多点田间试验和分子检测结果证明HGK60转基因抗虫玉米中外源基因稳定的遗传和表达,对亚洲玉米螟有很好的抗性,农艺性状与对照材料无显著差异。HGK60转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟的良好抗性使其具有很好的产业化应用前景。

关键词： cry1ah 转基因玉米遗传稳定性农艺性状

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一株含cry新基因的苏云金杆菌菌株的研究

华北农学报 2011年第1期26卷 54-57页

作者：宋萍郭丽伟苏俊平王勤英河北农业大学植物保护学院河北保定071001

苏云金杆菌XPZ-9菌株是从土壤中分离的对鳞翅目幼虫有特异杀虫活性的新菌株。光学显微镜下观察到该菌株可产生菱形和圆形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为70 kDa。PCR-RFLP分析结果表明该菌株含有新基因cry1ah。生物... 详细信息

苏云金杆菌XPZ-9菌株是从土壤中分离的对鳞翅目幼虫有特异杀虫活性的新菌株。光学显微镜下观察到该菌株可产生菱形和圆形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为70 kDa。PCR-RFLP分析结果表明该菌株含有新基因cry1ah。生物活性测定表明该菌株对鳞翅目害虫棉铃虫、小菜蛾、亚洲玉米螟和美国白蛾的二龄幼虫都具有较强的杀虫活性。

关键词：苏云金杆菌小菜蛾 cry1ah 美国白蛾

抗虫/耐草甘膦双价融合基因表达载体的构建及烟草转化

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生物技术通报 2011年第10期27卷 114-119页

作者：祁伟彦孙鹤周妮朱莉郎志宏黄大昉中国农业科学院生物技术研究所北京100081

随着植物基因工程的发展,将多个基因转化植株已成为研究的热点之一,利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。利用连接多肽2A和LP4/2A分别将抗虫基因Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)cry1ah和耐草甘膦基因mG2-epsps连接起来,构建... 详细信息

随着植物基因工程的发展,将多个基因转化植株已成为研究的热点之一,利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。利用连接多肽2A和LP4/2A分别将抗虫基因Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)cry1ah和耐草甘膦基因mG2-epsps连接起来,构建了4个融合基因表达载体pHAG、pHLAG、pGah、pGLah和两个单基因载体pSah、pSmG2,其中pHAG、pHLAG是Bt cry1ah基因在前,mG2-epsps基因在后,pGah、pGLah是mG2-epsps基因在前,Bt cry1ah基因在后,分别用2A和LP4/2A作为连接肽,由CaMV35S启动子驱动。利用农杆菌介导法将6个植物表达载体转入烟草,得到再生植株529株。经PCR检测,有261株再生苗为阳性植株,转化率达到49.3%。获得的转基因烟草可用于分析连接肽2A和LP4/2A的剪切效率以及不同基因与连接肽连接位置差异对基因表达的影响。

关键词： cry1ah mG2-epsps 2A LP4 转基因烟草

抗虫/耐草甘膦融合基因表达载体的构建及在转基因烟草中的分析

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抗虫/耐草甘膦融合基因表达载体的构建及在转基因烟草中的分析

作者：李艳萍河北农业大学

学位级别：硕士

随着植物基因工程的发展，将多个基因转化植株已成为研究的热点之一，利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。以2A和LP4为连接肽表达的融合基因在植物中表达时会发生剪切，将两个基因分开。本论文利用连接多肽2A和LP4/2A分... 详细信息

随着植物基因工程的发展，将多个基因转化植株已成为研究的热点之一，利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。以2A和LP4为连接肽表达的融合基因在植物中表达时会发生剪切，将两个基因分开。本论文利用连接多肽2A和LP4/2A分别与抗虫新基因Bt crylah和编码EPSP合酶的耐草甘膦基因mG连接起来构建融合基因表达载体，既可以达到两个基因的融合，又可以通过剪切形成两个蛋白分别行使功能。为了比较连接肽2A和LP4/2A的剪切效率，以及不同基因与连接肽连接位置差异对基因表达的影响，利用重叠PCR及DNA克隆技术共构建了四个融合基因表达载体：pHAG、pHLAG、pGah、pGLah。其中pHAG、pHLAG为crylah基因在前，mG基因在后，前者以2A为连接肽，后者以LP4/2A为连接肽;pGah、pGLah为mG基因在前，crylah基因在后，前者以2A为连接肽，后者以LP4/2A为连接肽。同时构建了两个单基因载体pSah、pSmG作为对照，比较两基因在不同载体中表达量的异同。利用农杆菌介导法将构建的植物表达载体转入烟草中，得到再生植株529株，经GUS组织化学分析，其中有261株再生苗为阳性植株，转化率达到49.3％;对GUS检测结果阳性的植株，分别利用crylah，mG基因内部引物进行PCR扩增，结果表明目的基因整合到了烟草的基因组中;RT-PCR结果显示转化的外源融合基因在烟草体内正确转录，融合基因在转录水平上没有发生剪切;Western Blot结果表明crylah基因和mG基因在植物体内正确翻译并且完全剪切;ELISA检测转融合基因表达载体pGLah烟草中mG蛋白的表达量达到转基因烟草叶片可溶性总蛋白的0.33％，明显高于对照载体及其它融合基因表达载体，而crylah在各载体中的表达量都在0.2％以上。将获得的转基因烟草进行了生物活性测定。抗虫性生测为棉铃虫初孵幼虫，结果表明转融合基因表达载体植株对棉铃虫的校正死亡率均在90％以上;草甘膦耐受性检测选用浓度为3‰的草甘膦喷洒T代植株叶片，融合基因表达载体pGLah表现出良好的抗性，存活率为100％，还对T代转基因烟草种子在含有草甘膦培养基上的出芽及生长情况进行了统计，结果表明转融合基因表达载体的转基因植株具有草甘膦耐受性，其中转融合基因表达载体pGLah的烟草种子可以在5mM的草甘膦培养基中正常发芽、生长，高耐植株占检测植株的87.5％。相对于单价基因表达载体，融合基因表达载体表现出较高的抗虫性和耐草甘膦性。以上转基因烟草的分子生物学分析以及生物活性分析均证明：以LP4/2A为连接肽时，两个基因的表达水平高于单独表达的基因，同时在连接肽前面基因的表达要高于其在连接肽后面基因的表达。

关键词： cry1ah mG2 融合基因表达载体转基因植株烟草