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拟穴青蟹抗菌肽crustin新变体的表达特性与抗菌功能

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厦门大学学报（自然科学版） 2019年第3期58卷 358-365页

作者：王晓飞彭会陈芳奕张财亮黄文树集美大学水产学院福建厦门361021 厦门大学海洋与地球学院福建厦门361102 福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心福建厦门361021

crustins是一类较早发现并广泛分布在甲壳动物中且富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,能够参与抗菌免疫应答.从拟穴青蟹( Scylla paramamosain )中克隆获得一个 crustin 基因新变体,命名为 SpCrus1a ,其cDNA序列全长744 bp,开放阅读框编码113... 详细信息

crustins是一类较早发现并广泛分布在甲壳动物中且富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,能够参与抗菌免疫应答.从拟穴青蟹( Scylla paramamosain )中克隆获得一个 crustin 基因新变体,命名为 SpCrus1a ,其cDNA序列全长744 bp,开放阅读框编码113个氨基酸,成熟肽分子质量10.03 ku,理论等电点8.30.表达分析结果发现其转录本主要存在于鳃、卵巢、上皮组织中,经脂多糖刺激后 SpCrus1a 表达会上调.体外合成 Sp Crus1a 的第29~47位氨基酸( Sp Crus1a 29-47 )进行抗菌活性实验,发现其对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性,而对被测的革兰氏阴性菌抗菌活性较弱或无抗菌活性.浓度24 μmol/L的合成肽 Sp Crus1a 29-47 能够在5 min内杀死大多数的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),在120 min内杀死全部的金黄色葡萄球菌.扫描电镜分析发现合成肽 Sp Crus1a 29-47 可造成金黄色葡萄球菌表面结构崎岖不平,高浓度 Sp Crus1a 29-47 会引起细菌大量死亡.上述结果表明 Sp Crus1a是抗菌肽crustin的新变体.

关键词：拟穴青蟹 crustin cDNA克隆抗菌活性扫描电镜

拟穴青蟹两个crustin新变体的克隆与表达分析

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厦门大学学报（自然科学版） 2019年第4期58卷 505-515页

作者：张财亮黄贝熊静陈芳奕黄文树集美大学水产学院福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心福建厦门361021 海洋生物制备技术国家地方联合工程实验室福建厦门361102 农业部东海海水健康养殖重点实验室福建厦门361021

crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均... 详细信息

crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均含有12个位置高度保守的半胱氨酸.SpCrus1b在信号肽和乳清酸蛋白(WAP)结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,属于典型的Ⅰ型crustins;SpCrus2b除具有SpCrus1b的结构特征外,在近N-端额外含有一个甘氨酸富集区,属于典型的Ⅱ型crustins.基因组结构分析显示SpCrus1b的基因组DNA序列为4个外显子/3个内含子结构,而SpCrus2b的基因组DNA序列为2个外显子/1个内含子结构.两者均主要在鳃中表达,且在脂多糖(LPS)刺激24h和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激12h后表达量均极显著上调(p<0.01),表明SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹抗细菌和抗病毒的先天免疫过程.

关键词：抗菌肽 crustin 基因克隆基因组表达分析拟穴青蟹$

凡纳对虾crustin 2基因的序列及结构分析

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湖北农业科学 2013年第18期52卷 4526-4528页

作者：杜志强吴亚坤林涛内蒙古科技大学生物工程与技术研究所内蒙古包头014010

以凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)crustin 2基因为研究对象,通过基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化树分析以及分子结构的初步预测。结果表明,crustin 2基因可能在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要的抗菌功能,是一个重要的免疫效... 详细信息

以凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)crustin 2基因为研究对象,通过基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化树分析以及分子结构的初步预测。结果表明,crustin 2基因可能在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要的抗菌功能,是一个重要的免疫效应基因。

关键词：凡纳对虾(Litopenaeus vannamei) crustin 2基因克隆分析

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三疣梭子蟹crustin抗菌肽的研究

三疣梭子蟹Crustin抗菌肽的研究

作者：郑兆祥浙江海洋学院

学位级别：硕士

在前期研究中，我们从三疣梭子蟹血细胞克隆了一个I型crustin基因，并构建了crustin真核表达载体pVT102U/α-rcrustinI，转化酿酒酵母S18菌株得到分泌型表达重组抗菌肽rcrustinI的基因工程酵母菌。为研究重组抗菌肽rcrustinI的生物活性... 详细信息

在前期研究中，我们从三疣梭子蟹血细胞克隆了一个I型crustin基因，并构建了crustin真核表达载体pVT102U/α-rcrustinI，转化酿酒酵母S18菌株得到分泌型表达重组抗菌肽rcrustinI的基因工程酵母菌。为研究重组抗菌肽rcrustinI的生物活性，本研究通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、C18反向柱层析从基因工程菌发酵液中分离纯化出重组抗菌肽rcrustinI纯品。对纯化的重组抗菌肽rcrustinI功能和性质进行研究发现：rcrustinI具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌都有抑菌活性，敏感菌中对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)抑菌活性最强，最低抑菌浓度为0.36uM;同时检测到rcrustinI也有胰蛋白酶抑制剂活性;耐热性试验显示rcrustinI对热具有一定耐性，70℃时还能很好地保持抑菌活性;耐酸性试验显示pH6时，对抑菌活性没有影响，随着pH值降低，抑菌活性减弱，提示rcrustinI不适宜在酸性条件下应用。在本研究中，通过对三疣梭子蟹血细胞均一化全长cDNA文库进行筛选，鉴定出1个crustin初始转录物的选择性剪接体。与I型crustin比较，该选择性剪接体缺失了信号肽区和Cys富集区，仅保留了Pro-Arg区和WAP结构域，是1个典型的III型crustin，首次证明在crustin家族中也存在通过选择性剪接机制表达不同crustin异构体现象。通过扩增三疣梭子蟹crustin基因组DNA，对crustin基因结构进行研究。在crustin基因中2个外显子被1个内含子隔开，在外显子2中有1个选择型外显子。crustin初始转录物通过切除内含子将外显子1和外显子2连接形成I型crustinmRNA;切除内含子和选择性外显子则形成III型crustin的mRNA，且选择性外显子的剪切边界为稀有的TG/GG型内含子边界。采用半定量RT-PCR技术研究crustin2个选择性剪接体在不同组织及副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）诱导前后的基因表达差异结果显示：crustinI和crustinIII血液、肝胰脏、胃、肌肉等组织中均表达，其中crustinI在血液中表达量最大，与其他组织差异显著;而crustinIII只有胃的表达量与血液差异显著。副溶血弧菌感染前后crustinI和crustinIII表达量均发生显著变化，二者均参与副溶血弧菌的免疫防御反应，是免疫相关基因。

关键词：三疣梭子蟹 crustin 选择性剪接基因表达

拟穴青蟹抗菌肽crustin的表达特性及其抗菌机制的研究

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拟穴青蟹抗菌肽Crustin的表达特性及其抗菌机制的研究

作者：王晓飞集美大学

学位级别：硕士

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是中国东南沿海重要的海水养殖蟹类,养殖过程中持续遭受病原微生物的感染。抗菌肽(Antimicrobial peptide)是青蟹先天免疫系统中的重要效应分子,其具有的广谱抗菌活性、不易产生耐药性等特性使其成为传统... 详细信息

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是中国东南沿海重要的海水养殖蟹类,养殖过程中持续遭受病原微生物的感染。抗菌肽(Antimicrobial peptide)是青蟹先天免疫系统中的重要效应分子,其具有的广谱抗菌活性、不易产生耐药性等特性使其成为传统抗生素的替代者之一。crustins是目前蟹类中研究比较广泛的一类抗菌肽,为揭示青蟹抗菌肽crustin的功能,本论文选取SpCrus5(GenBank登录号MF431586)和SpCrus6(GenBank登录号MF431585),利用体外重组表达或肽段合成方式,确定抗菌谱和抗菌活性,揭示其杀菌机制。实验结果如下:(1)联合多肽Scy-SpCrus5的真核重组表达及抗菌活性:构建pPIC9K-Scy-SpCrus5真核表达载体,转入毕赤酵母(Pichia Pastoris)GS115进行诱导表达,结果显示,甲醇诱导浓度0.5%,28oC下培养24 h时表达联合多肽Scy-SpCrus5。大量表达后采用镍柱亲和层析纯化,将获得的目的抗菌肽进行体外抗菌活性研究。结果表明,15μM下重组表达的联合多肽,对所选的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌无明显的杀菌作用。(2)Scy-SpCrus5对金黄色葡萄球菌的作用机制:联合多肽Scy-SpCrus5与金黄色葡萄球菌共孵45 min,共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察抗菌肽与微生物互作后的定位情况,结果显示,联合多肽Scy-SpCrus5可作用于金黄色葡萄球菌细胞表面,而Scygonadin处理下(对照组)无该现象;进一步酶联免疫吸附试验(ELISA)实验研究Scy-SpCrus5与金黄色葡萄球菌细胞壁组分的结合情况,结果显示,在浓度0.5μM时,联合多肽Scy-SpCrus5即可结合脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA),且结合效率与蛋白浓度呈正相关。(3)SpCrus6抗菌活性及杀菌动力学曲线:生物信息学分析并预测SpCrus6具有抗菌活性,体外合成肽段SpCrus6进行抗菌活性实验,革兰氏阳性菌中,对谷氨酸棒状杆菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌有较强的杀菌作用,最小抑制浓度(Minimal inhibitory concentration:MIC)为64μM;革兰氏阴性菌中,对荧光假单胞菌、施氏假单胞菌抑杀作用较弱,MIC为248μM,对大肠杆菌模式株、弗氏志贺氏菌无抗菌活性,MIC为48μM,结果表明,SpCrus6对革兰氏阳性菌有更强抗菌活性。杀菌动力学曲线实验结果显示,当SpCrus6与金黄色葡萄球菌共孵5 min时,杀菌指数为50%,共孵2 h后,杀菌指数达到100%。(4)初步揭示SpCrus6对金黄色葡萄球菌的杀菌机制:当合成肽SpCrus6与金黄色葡萄球菌共孵45 min时,扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察到细菌细胞表面粗糙,表面结构崎岖不平,出现大量细胞碎片,而对照组细菌细胞光滑、完整、细胞形态未改变。透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察到细胞质膜破裂,甚至完全消失,细菌周围出现碎片,而对照组细菌细胞质膜完整,膜结构清晰可见且连续。流式细胞仪分析SYTO 9/PI的摄入情况,结果显示,SpCrus6处理后的金黄色葡萄球菌对荧光染料PI的摄入量明显增多,揭示SpCrus6可以改变金黄色葡萄球菌细胞质膜的通透性。

关键词： crustin 真核表达拟穴青蟹抗菌肽抗菌机制

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）抗菌肽crustin的基因克隆和表达分析

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三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）抗菌肽crustin的基因克...

作者：宋呈文中国科学院研究生院（海洋研究所）

学位级别：硕士

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的经济蟹类，广泛分布于中国、日本及朝鲜等海域。随着养殖业的不断发展，梭子蟹病害的发生也越来越频繁，包括细菌病、病毒病、真菌病等，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。在这种情... 详细信息

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的经济蟹类，广泛分布于中国、日本及朝鲜等海域。随着养殖业的不断发展，梭子蟹病害的发生也越来越频繁，包括细菌病、病毒病、真菌病等，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。在这种情况下，蟹类免疫防御机制的研究和抗病品系的选育对蟹的养殖具有重要的潜在意义。本研究在已经构建的三疣梭子蟹眼柄和血细胞cDNA文库的基础上，通过对表达序列标签(EST)进行分析，从中鉴定出2种crustin基因(Ptcrustin2和Ptcrustin3)。Ptcrustin2cDNA全长为1105bp，包含一个297bp的开放阅读框，编码98个氨基酸，分子量为10.97kDa，等电点为5.23。Ptcrustin3cDNA全长为629bp，包含一个348bp的开放阅读框，编码115个氨基酸，分子量为12.65kDa，等电点为6.42。在Ptcrustin2和Ptcrustin3氨基酸的N端都有一段信号肽序列，C端一个WAP结构域，两者之间为一个半胱氨酸-富含结构域。基因组序列分析表明，Ptcrustin2和Ptcrustin3是由不同的基因位点编码，Ptcrustin2基因片段包含三个外显子和两个内含子，而Ptcrustin3基因片段含有四个外显子和三个内含子，所有的内含子剪接位点都有典型的GT和AG二核苷酸剪接信号。通过对敏感群体和耐受群体样品的直接测序，在Ptcrustin2和Ptcrustin3基因组序列中分别发现了3和4个与梭子蟹对溶藻弧菌敏感/抗性相关的SNP位点。这些相关性SNP多数位于内含子内，只有Ptcrustin3中的位点87位于外显子中，且为非同义突变。此外，在Ptcrustin2的第二个内含子中发现了一个与敏感/抗性相关的微卫星位点。两种crustin亚型在健康梭子蟹不同检测组织中均有表达。与以往发现的crustin不同，Ptcrustin2和Ptcrustin3分别在眼柄和鳃中的表达量最高，而在血细胞中的表达量很低。在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母刺激后，Ptcrustin2和Ptcrustin3基因的时序表达变化有明显的不同，Ptcrustin2在受到刺激后表达量明显上升，并在24小时达到最大值;Ptcrustin3在受到刺激后表达量迅速上升，在4小时或8小时达到了最大值，这说明在面对微生物刺激时，Ptcrustin3比Ptcrustin2反应更迅速、敏感。两种重组蛋白的抗菌谱很相似，都对革兰氏阳性菌藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌有一定的抑制作用。此外，重组蛋白Ptcrustin2对毕赤酵母也有一定的抑菌效果;Ptcrustin3对革兰氏阴性菌溶藻弧菌也有较强的抑制作用。杀菌实验显示重组蛋白Ptcrustin2和Ptcrustin3都能够在孵育6小时内迅速杀死藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，因此Ptcrustin2和Ptcrustin3具有杀菌作用。以上研究结果揭示了三疣梭子蟹crustin不同亚型的分子基础、组织分布特点、对微生物响应特点和抗菌性。此外，SNP位点的研究对深入认识三疣梭子蟹的免疫防御机制，指导优良品种选育具有一定的参考价值。

关键词：三疣梭子蟹 crustin 基因组结构 SNP 表达模式抗菌活性

克氏原螯虾一种新型crustin抗细菌机制的初步研究

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克氏原螯虾一种新型Crustin抗细菌机制的初步研究

作者：焦厚琪华中农业大学

学位级别：硕士

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）简称小龙虾,是我国重要的经济虾类,广泛分布于我国东南部和中部地区。近年来,随着人们需求的不断上升,养殖业的不断发展,养殖过程中的病害也不断爆发,包括细菌病、病毒病等,给克氏原螯虾养殖业带来了... 详细信息

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）简称小龙虾,是我国重要的经济虾类,广泛分布于我国东南部和中部地区。近年来,随着人们需求的不断上升,养殖业的不断发展,养殖过程中的病害也不断爆发,包括细菌病、病毒病等,给克氏原螯虾养殖业带来了巨大的经济损失。克氏原螯虾作为无脊椎动物缺乏适应性免疫系统,主要通过先天免疫系统来对抗病原体的入侵。抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMP）作为无脊椎动物先天免疫系统中的重要效应分子,因其具有广谱的抗菌活性和不易产生耐药性等优点使其成为传统抗生素的替代者之一。甲壳素（crustin）是目前克氏原螯虾中研究比较广泛的一类抗菌肽,本研究扩增鉴定了来自克氏原螯虾中的一种新型crustin,命名为Pc-Cru L（Procambarus clarkii crustin L）。为揭示Pc-Cru L在克氏原螯虾中的功能,利用体外重组表达的方式,确定了其抗菌活性。以期从天然免疫的角度揭示其与病原体的关系,并为克氏原螯虾养殖病害的防控和药物的开放发提供一定的科学依据。主要内容如下:在克氏原螯虾中扩增Pc-Cru L基因,将该基因连接至p GEX-4T-1载体,构建原核表达质粒,将重组质粒在感受态BL21（DE3）中诱导表达纯化,进行体外和体内抗菌实验。Pc-Cru L的CDS区包含330bp,编码109个氨基酸。Pc-Cru L在正常克氏原螯虾的各组织中均有表达,在血淋巴中表达水平较高,而在肝胰腺中表达水平相对较低。体外抑菌结果表明,Pc-Cru L蛋白明显抑制了副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的生长,具有广谱的抑菌活性。通过注射外源重组的Pc-Cru L蛋白可提高克氏原螯虾感染副溶血弧菌的存活率。总体而言,Pc-Cru L是克氏原螯虾中重要的免疫分子,在防御克氏原螯虾的细菌感染中起着至关重要的作用。

关键词：克氏原螯虾抗菌肽 crustin Pc-CruL 副溶血弧菌

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日本沼虾抗菌肽基因的筛选和生物信息学分析

日本沼虾抗菌肽基因的筛选和生物信息学分析

作者：王一丽河北大学

学位级别：硕士

抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是存在于甲壳动物和马蹄蟹中的一种具有广谱抗菌活性和抗病毒活性的抗菌肽。本研究中,我们通过从已经建立的日本沼虾转录组中分析筛选出6种ALF基因序列,分别命名为MnALF1-6,并通过cDN... 详细信息

抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是存在于甲壳动物和马蹄蟹中的一种具有广谱抗菌活性和抗病毒活性的抗菌肽。本研究中,我们通过从已经建立的日本沼虾转录组中分析筛选出6种ALF基因序列,分别命名为MnALF1-6,并通过cDNA末端快速扩增的方法克隆了它们的全长cDNA序列。根据分子系统发育分析显示,这些基因的产物都与罗氏沼虾同系物具有很高的相似性,尤其在LPS结构域部分。通过实时荧光定量PCR分析,在健康成虾的血细胞中MnALF2和MnALF4的相对表达量最高,在肠道中MnALF3和MnALF4的相对表达量最高。在嗜水气单胞菌的免疫诱导下,沼虾不同组织中少数ALF基因出现下调表达,但多数ALF基因呈上调表达模式。为了验证ALF的抗菌活性与LPS结构域的关系,我们合成了MnALF2的LPS结构域部分肽段,用来进行抑菌实验和溶血活性实验。抗菌活性实验发现合成的MnALF2多肽对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有强大的广谱抗菌活性,但对真菌没有明显的抑制活性。溶血实验中合成的MnALF2多肽在浓度为0.67-33.50μM时表现出较弱的溶血活性(约10%),在浓度达到67μM时溶血活性约为22%。这项研究有利于我们更深入的了解淡水虾先天免疫中ALFs的抗菌作用,并表明这些抗菌肽或其衍生物有可能成为一种高效的新型抗菌药物。利用本地库比对程序,在日本沼虾转录组中查找罗氏沼虾crustin基因的同源序列,比对结果显示日本沼虾转录组中存在13条与罗氏沼虾crustin相似性很高的序列。我们对这13条序列进行生物信息学分析,结果显示这13条序列都具有乳清酸蛋白(WAP)结构域且大多都存在信号肽,因此推测这13条序列应该是日本沼虾中存在的crustin基因序列,并将其命名为Mncrustin1-13。日本沼虾crustins是富含半胱氨酸的阳离子多肽,且一般在N端包含一个功能域(富含甘氨酸,脯氨酸或半胱氨酸),在C端含有一个带有4个二硫键的乳清酸蛋白(WAP)结构域。

关键词：抗脂多糖因子先天性免疫抗菌活性 crustin 日本沼虾序列多样性

合浦绒螯蟹四种抗菌肽基因克隆及在弧菌胁迫下的表达

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合浦绒螯蟹四种抗菌肽基因克隆及在弧菌胁迫下的表达

作者：任天娇北部湾大学

学位级别：硕士

合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)俗称毛蟹,属绒螯蟹属,和中华绒螯蟹为不同的地理亚种。合浦绒螯蟹经济价值较高,易受到各种环境因子胁迫,但关于合浦绒螯蟹应对这些因子胁迫的免疫调控研究相比于中华绒螯蟹较少。因此,本研究对抗菌肽两... 详细信息

合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)俗称毛蟹,属绒螯蟹属,和中华绒螯蟹为不同的地理亚种。合浦绒螯蟹经济价值较高,易受到各种环境因子胁迫,但关于合浦绒螯蟹应对这些因子胁迫的免疫调控研究相比于中华绒螯蟹较少。因此,本研究对抗菌肽两个家族中的四个基因进行克隆与表达研究。主要研究结果如下:1)ALF2基因克隆及在弧菌胁迫下的表达合浦绒螯蟹ALF2(EhALF2)基因CDS长为363 bp,编码了120个氨基酸。序列分析发现,EhALF2具有ALF家族典型的结构域,即含有两个保守半胱氨酸的LPS结合域(LBD)。在溶藻弧菌胁迫下,在心脏中不同时间段EhALF2的表达量多数高于肝胰腺和鳃。在肝胰腺中,EhALF2基因在48 h时表达量最高;在鳃中,EhALF2基因在6 h时表达量最高;在心脏中,EhALF2基因在12 h时表达量最高。在副溶血弧菌胁迫下,在肝胰腺中不同时间段EhALF2的表达量多数高于心脏和鳃。在肝胰腺和鳃中,EhALF2基因都在12 h时表达量最高;在心脏中,EhALF2基因在6 h时表达量达到最高值。2)ALF3基因克隆及在弧菌胁迫下的表达合浦绒螯蟹ALF3(EhALF3)基因CDS长为372 bp,编码了123个氨基酸。序列分析发现,EhALF3具有含两个保守半胱氨酸的LPS结合域(LBD)。在溶藻弧菌胁迫下,在肝胰腺和心脏中不同时间段EhALF3的表达量多数差异不显著。在肝胰腺中,EhALF3基因在3 h时表达量最高;在鳃中,EhALF3基因在9 h时表达量最高;在心脏中,EhALF3基因都在12 h时表达量最高。在副溶血弧菌胁迫后,在肝胰腺中不同时间段EhALF3的表达量都多数高于鳃。在肝胰腺中,EhALF3基因在48 h时表达量最高;在鳃中,EhALF3基因在12 h时表达量最高;在心脏中,EhALF3基因在6 h时表达量达到最高值。3)crustin1基因克隆及在弧菌胁迫下的表达合浦绒螯蟹crustin1(EhCru1)基因CDS长为315 bp,编码了104个氨基酸。序列分析发现,EhCru1拥有一个信号肽、一个Cys-rich区和一个含8个保守半胱氨酸的WAP结构域。根据分类原则,EhCru1属于Ⅰ型crustin。在溶藻弧菌胁迫下,在心脏中不同时间段EhCru1的表达量多数高于肝胰腺。在肝胰腺、鳃和心脏中,EhCru1基因都在48 h时表达量达到最高值。在副溶血弧菌胁迫下,在肝胰腺中不同时间段EhCru1的表达量多数高于鳃和心脏。在肝胰腺和鳃中,EhCru1基因都在12 h时表达量最高;在心脏中,EhCru1基因都在6 h时表达量达到最高值。4)crustin2基因克隆及在弧菌胁迫下的表达合浦绒螯蟹crustin2(EhCru2)基因CDS长为339 bp,编码了112个氨基酸。序列分析发现,EhCru2拥有一个信号肽、一个Cys-rich区和一个含9个保守半胱氨酸的WAP结构域。根据分类原则,EhCru2属于Ⅰ型crustin。在溶藻弧菌胁迫下,在心脏中不同时间段EhCru2的表达量都高于肝胰腺。在肝胰腺和心脏中,EhCru2都在48 h时表达量达到最高值;在鳃中,EhCru2基因在3 h时表达量最高。在副溶血弧菌胁迫后,在肝胰腺中不同时间段EhCru2的表达量都高于鳃和心脏。在肝胰腺和鳃中,EhCru2基因都在12 h时表达量最高;在心脏中,EhCru2基因都在6 h时表达量达到最高值。综上,本研究克隆了合浦绒螯蟹抗菌肽中的抗脂多糖因子EhALF2和EhALF3基因以及crustin基因家族中的EhCru1和EhCru2基因,通过荧光定量PCR分析了它们在不同组织和受到不同细菌胁迫后的表达变化情况,发现合浦绒螯蟹在溶藻弧菌或副溶血弧菌胁迫下,EhALF2、EhALF3基因和EhCru1、EhCru2基因的表达都显著上调,说明本实验中的四种抗菌肽基因都可能参与了合浦绒螯蟹的细菌免疫应答反应。但对于它们具体的功能及作用机制还有待于应用RNAi和过表达等技术更深一步地研究。

关键词：合浦绒螯蟹 ALF crustin 基因克隆基因表达弧菌