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髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

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安徽医科大学学报 2024年第3期59卷 413-417页

作者：吴旭铭王卉卉朱向玲周园园王安琪张慧茹刘崇涂佳杰安徽医科大学临床药理研究所合肥230032

目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和cre/loxp系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2... 详细信息

目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和cre/loxp系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。Spi1^(flox/flox)与Lyz2-cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。结论成功构建和鉴定髓系特异性Spi1 KO小鼠,为进一步揭示PU.1在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。

关键词：髓系特异性 Spi1 基因敲除 CRISPR/Cas9 cre/loxp PCR Western blot

基于cre/loxp系统的睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠模型的构建及敲除效率检测

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生物工程学报 2022年第8期38卷 2912-2927页

作者：杨仕赛赵瑄王雨虹郑红梅甘婷朱贵明贵州医科大学基础医学院贵州贵阳550025 贵州医科大学生物与工程学院生物与医学工程重点实验室贵州贵阳550025

极长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLC-PUFAs)是哺乳动物视网膜、睾丸等极少数组织中特有的脂肪酸,其生物合成的关键酶为极长链脂肪酸延长酶4(very long chain fatty acid elongase 4,Elovl4)。建立... 详细信息

极长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLC-PUFAs)是哺乳动物视网膜、睾丸等极少数组织中特有的脂肪酸,其生物合成的关键酶为极长链脂肪酸延长酶4(very long chain fatty acid elongase 4,Elovl4)。建立组织特异性敲除Elovl4基因的动物模型有利于深入研究VLC-PUFAs的生物学功能,因此,本研究基于cre/loxp系统,先分别构建了Stra8-cre小鼠和Elovl4 floxed小鼠,通过杂交获得(Elovl4[flox/+],Stra8-cre)杂合子基因敲除小鼠,再选择雌鼠与Elovl4 floxed纯合子雄鼠即Elovl4[flox/flox]雄鼠杂交,通过基因型鉴定筛选获得(Elovl4[flox/flox],Stra8-cre)纯合子小鼠。利用RT-PCR、qRT-PCR、Western blotting、免疫组化和免疫荧光检测Elovl4在睾丸组织中的敲除效率,结果表明,无论是杂合子还是纯合子基因敲除小鼠,其睾丸组织中Elovl4的表达在mRNA及蛋白水平显著下调,但其他组织未受影响。本研究成功构建了睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠,为后续研究VLC-PUFAs对雄性小鼠生殖功能的影响及相关分子机制提供可靠的动物模型。

关键词： cre/loxp 睾丸 Elovl4 Stra8-cre 特异性敲除

cre/loxp系统应用于毕赤酵母基因敲除的研究进展

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安徽农业科学 2023年第15期51卷 10-13,17页

作者：王未鲜韩铭海贵州理工学院分析测试中心贵州贵阳550000 贵州理工学院食品药品制造工程学院贵州贵阳550000

毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一,蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代,高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段,其中由cre/loxp系统介导的基因改造技术受到了科研人... 详细信息

毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一,蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代,高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段,其中由cre/loxp系统介导的基因改造技术受到了科研人员的广泛关注。综述了cre/loxp系统的基本原理、应用于毕赤酵母基因敲除的技术路线及其关键的技术问题。

关键词：毕赤酵母 cre/loxp 基因敲除

基于cre/loxp系统的无筛选标记转耐低磷转录因子GmPTF1大豆种质创制与分析

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作物学报 2019年第5期45卷 683-692页

作者：张小芳董秋平乔潇乔亚科王冰冰张锴李桂兰河北科技师范学院农学与生物科技学院河北昌黎066600 河北科技师范学院物理系河北秦皇岛066004

筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将cre/loxpGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β... 详细信息

筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将cre/loxpGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β-雌二醇诱导cre/loxp系统删除筛选标记基因,获得了无筛选标记的转GmPTF1基因大豆。用PCR法扩增删除标记基因后的重组序列并测序显示,筛选标记基因在大豆基因组中已经被完全删除,重组序列中目的基因序列正确并保持了正确开放读码框;loxp位点重组出现一种新的拼接类型,重组后2个loxp序列全部缺失,新重组拼接位点长38 bp,与NCBI数据库的其他序列均无同源性,并且重组涉及2个loxp位点的外侧翼序列,造成cre/loxp盒上游loxp和下游loxp外侧翼序列部分缺失。经过RT-PCR和Western杂交验证显示无筛选标记转基因大豆植株中GmPTF1能够正常转录和翻译,在根系、叶片及茎中的GmPTF1蛋白表达量均高于野生型对照,而在种子中与对照无显著差异。沙培试验表明,在低磷条件下无筛选标记转基因大豆苗期根系指标、生物干重、叶绿素含量和磷含量均显著高于野生型对照,而丙二醛含量低于对照。利用cre/loxp重组系统可以有效删除转基因大豆中的筛选标记基因。

关键词： cre/loxp GmPTF1 无筛选标记转基因大豆

利用CRISPR-Cas9和cre/loxp系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌

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食品与生物技术学报 2020年第11期39卷 71-80页

作者：丁志祥胡晓清柳亚迪王小元食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学国际食品安全联合实验室江苏无锡214122

L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统cre/loxp,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中p... 详细信息

L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统cre/loxp,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中puuE和ynaI区间的34个非必需基因(共30.372 kb),获得了突变菌MG003,然后通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*、thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比,MG003/pFW01-thrA*BC生长加快,L-苏氨酸产量提高25.5%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。研究结果表明,大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于其提高L-苏氨酸合成能力。

关键词：大肠杆菌 L-苏氨酸 CRISPR-Cas9 cre/loxp puuE ynaI

cre/loxp系统介导转基因山羊乳腺上皮细胞标记基因的删除

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生物技术通报 2019年第12期35卷 105-111页

作者：宋绍征于康英陆睿张婷陈朝军潘生强成勇周鸣鸣无锡太湖学院护理学院无锡214000 扬州大学兽医学院江苏省转基因动物制药工程研究中心扬州225009

为了消除核移植转基因动物中标记基因潜在的生物安全风险,应用cre/loxp系统删除人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊乳腺上皮细胞的标记基因,并以此探索标记基因删除前后对功能基因乳腺特异性表达的影响。首先复苏hLF转基因山羊乳腺上皮细胞并纯... 详细信息

为了消除核移植转基因动物中标记基因潜在的生物安全风险,应用cre/loxp系统删除人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊乳腺上皮细胞的标记基因,并以此探索标记基因删除前后对功能基因乳腺特异性表达的影响。首先复苏hLF转基因山羊乳腺上皮细胞并纯化;然后电转染PBS185纯化质粒,培养10-14 d,胰蛋白酶消化细胞,通过自制口控式移卵针挑取单克隆细胞;最后PCR检测标记基因是否删除,催乳素诱导表达,ELISA和Western Blot检测功能蛋白hLF的表达情况。结果表明,共获得65株单克隆乳腺上皮细胞,挑取状态较好的18株用于PCR检测,有3株为删除标记基因的细胞株,删除效率达16.7%(3/18),且删除标记基因细胞株表达水平提高约8倍(2.85 g·L^-1/0.35 g·L^-1),蛋白条带大小与目标蛋白一致(80 kD)。结果表明cre/loxp系统能够有效的删除乳腺上皮细胞基因组上的标记基因,且删除后细胞株表达水平明显提高,成功建立一套转基因山羊乳腺上皮细胞标记基因删除的系统,为进一步扩大生产无标记基因的转基因山羊奠定基础。

关键词：标记基因 cre/loxp hLF 乳腺上皮细胞诱导

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和cre/loxp基因敲除技术的比较

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微生物学通报 2019年第2期46卷 278-291页

作者：占米林阚宝军张辉董晋军许国超韩瑞枝倪晔江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和cre/loxp基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Corynebacteriumglutamicu... 详细信息

【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和cre/loxp基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的cre/loxp敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxp的kanR片段,然后由重组酶cre识别loxp位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与cre/loxp系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。

关键词：谷氨酸棒状杆菌 CRISPR-Cpf1 cre/loxp 同源重组基因敲除

基于蛋白拆分技术的cre/loxp系统在转基因拟南芥杂交后代中的删除效率分析

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基于蛋白拆分技术的Cre/loxP系统在转基因拟南芥杂交后代中的删除...

作者：文梦玲西南大学

学位级别：硕士

转基因技术问世以来发展迅速,广泛应用于农业生产。该技术能够提高农作物产量,改良农产品品质,提升农作物对逆境的抵抗能力,但是,由于外源基因随着花粉的扩散,由此也带来很多生物安全问题。这些生物安全性问题已经引起了公众的广泛关注... 详细信息

转基因技术问世以来发展迅速,广泛应用于农业生产。该技术能够提高农作物产量,改良农产品品质,提升农作物对逆境的抵抗能力,但是,由于外源基因随着花粉的扩散,由此也带来很多生物安全问题。这些生物安全性问题已经引起了公众的广泛关注和担忧,为了解决相关问题,越来越多的生物技术被采用,其中,位点特异性重组酶系统研究得比较广泛。cre/loxp重组酶系统以其简捷高效,因而广泛应用于动植物中删除转基因作物的外源基因。但是,该系统也存在明显的缺陷,即不能应用于杂交作物。根据前人研究报道,将完整的结构蛋白拆分为互补的两个部分,当拆分片段共表达时,能够实现蛋白结构的重建和恢复结构蛋白的活性。根据前期研究结果,本论文将采用cre蛋白核苷酸序列第866 bp为拆分位点,采用Intein介导的蛋白拆分技术将cre重组酶拆分为互补的N端和C端。分别构建两个植物表达载体,之后转化野生型拟南芥进行人工杂交。如果采用花原基特异性启动子控制拆分后重组酶片段的表达,则杂交后,在营养生长阶段外源功能基因仍可保留,到生殖生长阶段重组酶将删除外源基因,使种子和果实不含有外源基因,以期实现由转基因作物生产非转基因产品。此系统为基因删除系统在大田中的推广应用奠定了基础,并最终消除公众对转基因作物生物安全隐患的担忧。主要结果如下:一、内含肽对重组酶cre拆分后删除活性恢复的影响将cre蛋白从核苷酸序列第866bp处拆分为N端和C端,以pCA-loxp载体为基础,构建两个植物表达载体。其中一个采用Intein介导的蛋白拆分技术,命名为pNcre-Ccre;另外一个载体是将cre蛋白进行直接拆分,命名为pN-C,将两个载体转化农杆菌C58C1,之后转化烟草。发现pNcre-Ccre载体的GUS染色阳性率（31.3%）显著高于pN-C载体的GUS染色阳性率（20.1%）,说明内含肽介导的蛋白拆分可以显著提高拆分后蛋白片段结构重建的效率。二、内含肽介导的cre蛋白拆分在拟南芥杂交中的删除效率分析将重组酶cre拆分后的N端与内含肽的N端融合,内含肽C端与重组酶C端融合,以载体pCA-loxp为基础,分别构建两个植物表达载体,命名为pCA-Ncre-In和pCA-Ic-Ccre。将载体转化野生型拟南芥,筛选单拷贝纯合体进行人工杂交,通过对杂交子代GUS染色和测定GUS酶活,我们发现,拆分系统运用于拟南芥杂交中,可以高效地删除外源基因,效率最高达到96.736%。三、建立能彻底删除所有外源基因的基因删除系统改良植物表达载体的构建,将所有外源基因构建在两个同向loxp位点之间,两个loxp位点两侧即是T-DNA的左边界和右边界。将构建的两个植物表达载体分别转化野生型拟南芥,筛选单拷贝纯合体,之后进行人工杂交。通过对报告基因GUS和GFP的检测,以及杂交子代中目的基因的扩增,我们发现在杂交子代拟南芥中,虽然多数情况是部分删除,即并不是每一个植物细胞都发生了删除,而是部分细胞或者部分组织发生了完全删除,但单独的N端和C端的完全删除是存在的。因此,该研究为基因删除系统在大田中的应用奠定了基础。

关键词：生物安全 cre/loxp 基因删除蛋白拆分蛋白内含肽

A stringent dual control system overseeing transcription and activity of the cre recombinase for the liver-specific conditional gene knock-out mouse model

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Journal of Genetics and Genomics 2008年第7期35卷 431-439页

作者： Yu Wu Yinghua He Hongyu Zhang Xinlan Dai Xiaoyu Zhou Jun Gu Guan Wang Jingde Zhu Fudan University School of Medicine Shanghai 200032 China Cancer Epigenetics and Gene Therapy Program The State-key Laboratory for Oncogenes and Related Genes Shanghai Cancer Institute Shanghai Jiaotong University Shanghai 200032 China

Liver cancer is one of the most threatening diseases in Chinese population. Just like in other tissues, tumor initiation and development in liver involve multiple steps of genetic and epigenetic alterations with several unknown details. However, unlike in other tissues, a tissue specific inducible cre recombinase system that allows temporal and spatial deletion of a target DNA fragment is still not available for in vivo functional gene annotation in hepatocytes. In our pursuit to establish such a mouse model, we designed a dual inducible cre transgene system and tested it in cultured cells. By combining a CCAAT/enhancer binding protein β （C/EBP β） promoter derived Tet-off expression system and the estrogen receptor （ER） mediated functional control, we show a desirable profile of both hepatocyte-specificity and regulability of the cre expression in a series of critical assessments in the cell culture system, which provides confidence in continuation of our ongoing pursuit in mouse.

关键词： cre/loxp Tet-off hepatocyte-specific doxycycline 4-OHT C/EBβ