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小鼠心脏干细胞功能的年龄相关性变化及其调节机制

小鼠心脏干细胞功能的年龄相关性变化及其调节机制

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作者：詹金熹广西师范大学

学位级别：硕士

目的:心脏干细胞在维持心脏组织自稳态和心脏损伤后的修复中起关键性作用,其由衰老引起的功能退行性变化可能是年龄相关心脏病的主要因素之一。本研究利用实验动物C57BL/6J小鼠,旨在分离鉴定具有分化和自我更新能力的心脏干细胞群和探... 详细信息

目的:心脏干细胞在维持心脏组织自稳态和心脏损伤后的修复中起关键性作用,其由衰老引起的功能退行性变化可能是年龄相关心脏病的主要因素之一。本研究利用实验动物C57BL/6J小鼠,旨在分离鉴定具有分化和自我更新能力的心脏干细胞群和探明其功能的年龄相关性变化的特征。本研究的另一个目的是,通过重点分析转录辅助因子cited 2的可能作用以及青年和老年组心脏干细胞基因表达谱的比较,初步阐明心脏干细胞衰老的分子调控机制。方法:(1)小鼠心脏干细胞分离:断颈法处死C57BL/6J小鼠后,取心脏组织并通过机械剪碎和胶原酶Ⅱ消化处理及细胞筛过滤获得单细胞悬液。(2)小鼠心脏干细胞流式分析及分选:新鲜分离的细胞经4种抗表面标志蛋白荧光抗体孵育后,进行流式表型、细胞周期分析和分选。(3)心脏干细胞分化和增殖能力检测:分选得到的心脏干细胞经特定的分化和增殖培养基诱导培养,培养结束后用抗标志蛋白荧光抗体和CFSE染色,通过荧光显微镜及流式细胞仪测定分化及增殖状况。(4)cited 2调控机制研究:以慢病毒为载体构建cited 2敲低和过表达系统,通过慢病毒转染分选得到的心脏干细胞,利用自带GFP标志检测转染效率,转染成功后用puromycin筛选稳定转染的细胞株,加入分化培养基诱导其分化,并检测分化情况。(5)基因表达检测:分离得到的心脏干细胞提取总RNA后,逆转录合成cDNA,进行Real-time PCR和ddPCR,检测基因表达情况。(6)基因表达谱分析:GO分析、KEGG pathway分析。(7)统计方法:采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行“独立样本T检验”分析,统计结果以平均值±标准差表示。结果:(1)小鼠心脏干细胞的分离鉴定:我们以Sca-1为核心结合Lin、CD45和CD31三种表面标志物在小鼠心脏组织中发现了 Lin-CD45-Sca-1+CD31-和Lin-CD45-Sca-1+CD31+两个潜在的心脏干细胞亚群,分别占心脏总细胞的0.74±0.03%和3.38±0.30%。体外实验发现,Lin-CD45-Sca-1+CD31-细胞能在体外分化形成心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞,并能在体外增殖,而Lin-CD45-Sca-1+CD31+细胞则不具备分化和自我更新能力,表明Lin-CD45-Sca-1+CD31-细胞是真正的心脏干细胞。micro RNA(miRNA)和mRNA表达谱分析结果显示,与细胞干性相关的20个miRNA和49个mRNA在Lin-CD45-Sca-1+CD31-和Lin-CD45-Sca-1+CD31+两个细胞亚群中呈现相反的表达情况,从分子水平上进一步印证了两者细胞属性的差别。(2)小鼠心脏干细胞功能的年龄相关性变化:老年小鼠Lin-CD45-Sca-1+CD31-心脏干细胞的含量显著高于青年组(0.92±0.06%VS0.74±0.03%,P2.71%VS 7.72±2.64%,P24±11.23%VS 54.28±9.07%)和血管内皮细胞(64.85±10.68%VS 37.89±7.47%)的效率明显高于老年组(P2.86±12.62%VS 51.48±9.87%,Pcited 2对心脏干细胞分化的调控:老年小鼠心脏干细胞中cited 2的表达量较青年组显著下降(Pcited 2后,其分化为心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞的能力分别呈现下降和上升趋势。(4)心脏干细胞潜在衰老调控因子筛选:青年和老年小鼠心脏干细胞间有35个基因存在表达差异(FDR2),其中10个基因是在老年组中下调表达,而有25个基因则上调表达。这些基因主要涉及细胞增殖、细胞周期、节律调节、肿瘤转录失调、趋化因子信号转导通路、补体途径、NF-kappa B信号通路等有关。结论:(1)小鼠Lin-CD45-Sca-1+CD31-心脏干细胞是真正具有分化和自我更新能力的心脏干细胞,其数量在老年小鼠中增加,但其分化和自我更新能力都显著下降;(2)转录辅助因子cited 2在成体心脏干细胞功能的调控中可能起较重要的作用;(3)心脏干细胞衰老受到严格的内在机制调节,包括基因转录和表观遗传修饰等。

关键词：心脏干细胞衰老 cited 2 潜在调控因子

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