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chi基因导入对转Bt棉花抗病虫性的影响

农业生物技术学报 2004年第4期12卷 478-479页

作者：简桂良卢美光王志兴贾士荣邹亚飞程红梅孙文姬中国农业科学院植物保护研究所北京100094 北京100081 中国农业科学院植物保护研究所中国农业科学院生物技术研究所

将几丁质酶(chitinase,chi)基因导入国产抗虫棉GK19中,目前已选出既抗病又抗虫的棉花新株系[1],1999～2002年在北京对其抗枯萎病和黄萎病以及抗棉铃虫性进行了研究.……

关键词：棉花 chi基因抗虫性抗病性

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滇水金凤chi基因的克隆及表达分析

江西农业大学学报 2020年第3期42卷 468-474页

作者：李洋黄武略林福永罗超李新艺刘应丽朱佳鹏冯志熙黄美娟黄海泉西南林业大学园林园艺学院/园林园艺花卉研发中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心云南昆明650224

【目的】查尔酮异构酶(chalcone isomerase,chi)是花青素合成途径中的关键酶之一。通过克隆滇水金凤(Impatiens uliginosa)chi基因并对其进行表达分析,进而探究滇水金凤花色形成及变异机理,为凤仙花花色改良及新品种培育奠定了一定的基... 详细信息

【目的】查尔酮异构酶(chalcone isomerase,chi)是花青素合成途径中的关键酶之一。通过克隆滇水金凤(Impatiens uliginosa)chi基因并对其进行表达分析,进而探究滇水金凤花色形成及变异机理,为凤仙花花色改良及新品种培育奠定了一定的基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术进行基因克隆,利用DNAMAN和MEGA-X软件对所克隆基因的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,利用qRT-PCR分析chi基因的表达模式。【结果】克隆得到滇水金凤chi基因的2个片段,命名为Iuchi1和Iuchi2,其cDNA全长序列分别为741 bp和636 bp。同源性分析表明,滇水金凤chi基因的氨基酸序列与茶(ASU87415.1)、橄榄(AEO36936.1)等12个物种的序列同源性达到55.99%。系统进化分析表明,滇水金凤chi1和chi2均单独成一枝。表达分析表明,在红色滇水金凤中,2个chi基因在4个花发育时期的表达量均呈逐渐上升趋势,而在白色滇水金凤中的表达量在第3时期最高,在其它几个时期则相对较少。【结论】推测滇水金凤的2个chi基因为旁系亲缘关系,其在白色花和红色花的4个花发育时期的表达模式显示出一致性。

关键词：滇水金凤 chi基因基因克隆表达分析

不同植物chi基因密码子使用特性及其影响因素分析

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2020年第1期41卷 76-84页

作者：蒋守华陈香华李闯贾波李刚刘满霞赵祥祥秦进华江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所江苏淮安223001 淮阴师范学院江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室江苏淮安223001

查耳酮异构酶(chi)是类黄酮生物合成早期阶段的一个关键酶,在种皮发育和颜色形成过程中具有重要的调控作用,利用生物信息学软件分析22种植物chi基因的密码子使用偏好性特点及其影响因素。结果表明:单子叶植物chi基因偏好以碱基G/C结尾,... 详细信息

查耳酮异构酶(chi)是类黄酮生物合成早期阶段的一个关键酶,在种皮发育和颜色形成过程中具有重要的调控作用,利用生物信息学软件分析22种植物chi基因的密码子使用偏好性特点及其影响因素。结果表明:单子叶植物chi基因偏好以碱基G/C结尾,而双子叶植物对碱基G/C和A/U结尾的偏好程度相似,双子叶植物具有较高的ENC值和较低的Fop值,表明双子叶植物chi基因具有较弱的密码子偏好性;RSCU值聚类分析显示,AGG、AGA可能为植物chi基因最优密码子;影响因素分析表明,不同植物chi基因密码子不同位置的碱基组成差异程度较大,其偏好性主要受自然选择作用中的碱基组成(GC3s、GC12)影响较大,氨基酸平均亲水性(Gravy)对密码子使用偏好也有一定的影响;系统进化显示,大部分亲缘关系较近的物种密码子使用偏性也较相似,但某些传统分类上相似的物种存在一定的差异。

关键词：植物 chi基因密码子使用偏好性影响因素

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒p40、chi基因克隆及chi基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达

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棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒p40、chi基因克隆及chi基因在大...

作者：武家才浙江大学

学位级别：硕士

本文通过建立了棉铃虫（Helicoverpa armigera）单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV） Cl株基因组文库，并对一些克隆进行限制性内切酶分析、Southern杂交和序列测定鉴别出了编码p40基因全序列的HindIII-H、J片段及编码几丁质酶基因的Hi... 详细信息

本文通过建立了棉铃虫（Helicoverpa armigera）单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV） Cl株基因组文库，并对一些克隆进行限制性内切酶分析、Southern杂交和序列测定鉴别出了编码p40基因全序列的HindIII-H、J片段及编码几丁质酶基因的HindIII-E片段，进一步分析了p40基因序列和几丁质酶基因序列，并在大肠杆菌和昆虫细胞中表达了几丁质酶基因。在棉铃虫虫体内增殖了HaSNPV Cl株，从提纯多角体中提取基因组DNA。应用BamHI、 EcoRI、EcoRV、HindIII、PstI、XbaI和XhoI 7种限制性内切酶分别将基因组DNA完全酶切，条带数分别为11、19、22、13、6、16和5。以λDNA/HindIII酶切片段作为分子量标准，求得各片段的长度，推测出HaSNPV基因组大小为130kb左右，进一步选用HindIII、 XbaI、XhoI、HindIII+XbaI、HindIII+PstI、HindIII+XhoI完全酶切基因组DNA，构建了 HaSNPV基因组文库。用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI四种限制性内切酶分析基因组文库中的克隆，筛选出了基因组HindIII-E、H和J片段，其长度分别为10.6、10和6.7kb。对H和J片段末端测序得到HaSNPV p40基因全序列，HindIII-H和J片段分别编码其上游和下游序列。HaSNPV p40基因编码区全长966bp，与HzSNPV p40基因有98％的相同性，其翻译起始位点上游都有一个保守的晚期转录起始位点ATAAG。从HaSNPV p40基因核苷酸序列推测其编码蛋白分子量为36.58kD，其氨基酸序列与BmNPV p40和AcMNPV gp41的氨基酸序列相同性为55％左右，但HaSNPV p40的28-277氨基酸区域与SeMNPV、LdMNPV、AcMNPV、BmNPV、OpMNPV 的同源基因相对应区域比较，相似性在60％以上，并且七种基因中存在3个保守的半胱氨酸。对以上七种同源基因编码的氨基酸序列分析，结果表明P40蛋白溶解性都低于30％。进一步绘出了七种杆状病毒P40蛋白进化树。在对HaSNPV基因组HindIII-E片段限制性内切酶分析基础上，通过建立该片段随机克隆，测定了E片段全序列。该片段含有完整的、以ATG为起始密码子、编码多肽不少于 50个氨基酸的ORF 9个，其中包括编码几丁质酶基因的ORF。HaSNPV几丁质酶基因编码区全长1713bp，推测编码蛋白分子量为65.5kD，与HzSNPV几丁质酶基因编码的氨基酸序列有91％的相同性，与BmNPV和AcMNPV几丁质酶基因编码的氨基酸序列相同性为66％，与粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）几丁质酶A（chiA）基因编码的氨基酸序列相同性为 55％。HaSNPV几丁质酶对应于S. marcescens chiA的催化区域有73％相同性、86％相似性。 HaSNPV几丁质酶对应于S. marcescens chiA纤粘连蛋白III型组件结构区域相同性达41％，相似性为58％。通过与HzNPV几丁质酶基因编码氨基酸序列比较识别出其N端有一个由20 个疏水性氨基酸组成的假定信号肽序列，C端有一个假定的内质网保留信号序列HNEL。根据HaNPV几丁质酶基因5’端编码信号肽序列的假定，从基因组HindIII-E片段中扩增了HaSNPV几丁质酶全部编码区基因（chi）和HaNPV缺失假定信号肽的几丁质酶的编码区基因（chjs人习Chf。Chjs书其阅读框构建到pErl’28a载体中，得到pETchi、pETcllis－两个表达克隆。pETchi、pEI’chis－转入大肠杆菌皿3中诱导表达，通过SDS－PAGE及Western 印迹检测，确定表达出分子量为60kD人右的蛋臼。将PCR扩增出的HaSN＊ chls－基因构建到杆状病毒－昆虫表达系统的供体质粒 pFASTBACHTa中，通过转座作用将目的基因重组进穿梭载体Bacmid中，重组Bacmid在 LIPfectin介导下共转染粉纹夜蛾细胞．连续传代感染四次后，PCR检测到细胞中含重组有目的基因的病毒，对感染细胞进行SDS干AGE分析，表明有特异性表达条带，其分子量为60M 左右。本论文的创新点主要有： 1．首次克隆分析了flaSN。V vio基因，井确定了11aSNPV基

关键词： chi基因大肠杆菌棉铃虫多角体病毒序列测定几丁质酶基因

巨峰葡萄查尔酮异构酶(chi)基因的克隆及表达特性的半定量RT-PCR分析

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巨峰葡萄查尔酮异构酶(CHI)基因的克隆及表达特性的半定量RT-PCR...

芍药查尔酮异构酶基因(chi)克隆、密码子偏好性分析以及蛋白结构功能预测

第二届全国果树分子生物学学术研讨会

作者：周军彭日荷熊爱生蔡斌徐锦涛金晓芬陶建敏章镇姚泉洪南京农业大学园艺学院西南林学院资源学院上海市农业科院生物技术研究所

试验从一年生巨峰扦插苗中克隆了chi基因,并采用半定量RT-PCR技术,以actin基因为内参,分析了chi基因在巨峰葡萄果实不同发育阶段及组织的表达。对chi基因的序列分析表明:chi基因序列中含有3内含子,4个外显子;生物信息学分析表明,chi基... 详细信息

试验从一年生巨峰扦插苗中克隆了chi基因,并采用半定量RT-PCR技术,以actin基因为内参,分析了chi基因在巨峰葡萄果实不同发育阶段及组织的表达。对chi基因的序列分析表明:chi基因序列中含有3内含子,4个外显子;生物信息学分析表明,chi基因编码的多肽链既没有信号肽,也不存在跨膜结构域,且亚细胞定位于细胞质中。半定量RT-PCR分析结果表明,chi基因在果皮、果肉、种子及幼叶和幼根中都表达,但不同的组织中表达方式不同。chi基因在花后30和90天的果皮中强烈表达;但在果肉中,chi基因在花后90天表达强烈,而在种子中于花后45天表达强烈,随果实发育,其表达逐渐下降。在上述实验的同时,高温处理抑制chi基因在一年生盆栽巨峰葡萄幼叶中的表达,但随处理时间延长,其表达又有所恢复;高温诱导chi基因在幼根的表达。

关键词：克隆半定量RT-PCR chi基因生物信息学巨峰葡萄表达分析

来源： cnki会议评论

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华北农学报 2016年第2期31卷 71-80页

作者：吴彦庆赵大球王静陶俊扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009

为了丰富芍药chi基因研究的基础数据,首先利用RACE技术对芍药chi基因的CDS区进行克隆,并通过EMBOSS软件分析序列的密码子偏好性,其次利用生物信息学软件和在线数据库对芍药chi进行蛋白结构与功能预测。结果表明,克隆获得芍药chi基因c DN... 详细信息

为了丰富芍药chi基因研究的基础数据,首先利用RACE技术对芍药chi基因的CDS区进行克隆,并通过EMBOSS软件分析序列的密码子偏好性,其次利用生物信息学软件和在线数据库对芍药chi进行蛋白结构与功能预测。结果表明,克隆获得芍药chi基因c DNA序列长度为898 bp(Gen Bank序列号:JN119872),芍药chi基因偏好使用以A/U结尾的密码子,28种偏好密码子(RSCU>1),其中偏好性较强的有UUG、UGU、CAU、AGA、AGG、CGG(RSCU≥2),在密码子的使用频率上,芍药chi基因与酵母、大肠杆菌等模式生物基因组的差异均大于拟南芥基因组。芍药chi为非跨膜亲水的稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;主要分布在细胞质(45.0%)和微体(42.5%)中;无糖基化位点,14个磷酸化位点,其中第20位氨基酸处存在一个典型的磷酸激酶PKC,含有1个异构酶Chalcone保守结构域;二级结构包括α螺旋(39%)、延伸链(20%)、β-转角结构(13%)和无规则卷曲(27%);三级结构呈β-三明治折叠形成的倒置花束。发现了一个异构酶催化活性区域和一个重要的特异性蛋白质激酶PKC位点,为今后深入研究chi基因功能提供有利的基础资料,此外,拟南芥真核表达更适合作为芍药chi基因的外源表达系统。

关键词：芍药 chi基因密码子偏好性蛋白结构与功能

昆虫病原菌(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因chi克隆及生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2021年第3期40卷 1110-1114页

作者：常瑞刚宋小妹陈凤丽罗都强河北大学生命科学学院保定071000 河北大学化学与环境科学学院保定071000

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因chi进行克隆、测序及相关生物信息学分析。序列分析结果显示:Ifchi基因编码区全长为1152 bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二... 详细信息

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因chi进行克隆、测序及相关生物信息学分析。序列分析结果显示:Ifchi基因编码区全长为1152 bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二级结构为混合型,蛋白质溶剂可及性主要分为三类,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异。该昆虫病原菌玫烟色棒束孢Ifchi编码基因的成功克隆及生物信息学分析,为进一步研究病原菌chi基因的遗传特性和表达机制以及为寻找更多的查尔酮类化合物提供了理论基础。

关键词：昆虫病原菌 chi基因克隆生物信息学分析

广谱抗病基因chi和hrpZpsta双价植物表达载体的构建及其在大豆中的遗传转化

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广谱抗病基因chi和hrpZpsta双价植物表达载体的构建及其在大豆中...

作者：卢实吉林农业大学

学位级别：硕士

大豆（Glycine max）是我国重要的油料经济作物，种子中含有丰富的蛋白质及油质，营养成分完全，其中包括矿物质和多种维生素。但在生产过程中，真菌性病害严重限制了大豆产量与品质的提升。以大豆灰斑病为例，作为大豆主产区的重要病... 详细信息

大豆（Glycine max）是我国重要的油料经济作物，种子中含有丰富的蛋白质及油质，营养成分完全，其中包括矿物质和多种维生素。但在生产过程中，真菌性病害严重限制了大豆产量与品质的提升。以大豆灰斑病为例，作为大豆主产区的重要病害，灰斑病一般可造成减产10%，严重时甚至可减产30%—50%，同时籽粒中蛋白质及油份含量均有不同程度的降低。此外，大豆霜霉病，大豆锈病等都是限制大豆产量的主要因素，且都由真菌性病原菌所致。近年来植物基因工程技术的发展为作物的抗性育种提供了一种快速而有效的方法。几丁质，又称甲壳质，是真菌细胞壁的主要组成部分。来源于菜豆的几丁质酶基因(chitinasegene，chi)，可编码产生几丁质酶，几丁质酶是能催化降解几丁质的糖苷酶，水解几丁质中的β-1，4糖苷键，已达到抑制真菌生长的目的，因此研究认为几丁质酶在植物体内防御系统中起着重要的作用。而克隆于丁香假单胞菌烟草野火病病原菌的hrpZpsta基因可编码产生harpin蛋白，此蛋白能刺激高等植物产生过敏反应，使被真菌侵染的部位及周围细胞坏死，从而封锁致病菌，同样可以达到保护植物体免受病原菌侵害的目的。本研究构建了包含chi和hrpZpsta两种抗病机理不同但均为广谱抗病基因的双价植物表达载体pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta，利用农杆菌介导的大豆子叶节的转化，将两种广谱抗病基因导入受体大豆基因组中，获得了同时整合两种广谱抗病基因的转基因大豆，期望达到两种广谱抗病基因在细胞内水平和胞外水平协同作用于致病菌的效果，同时也为选育广谱抗病能力更强，抗病范围更广的大豆新品种奠定基础。主要研究结果如下：1．本研究共构建了两个载体，其中包括一个中间克隆载体pBI121-35S-chi-nos，以及一个以抗除草剂草丁膦bar基因为筛选标记的双价广谱抗病基因表达载体pCAMBIA3301-chi-hrpZpsta，并利用农杆菌介导法完成抗病基因chi和hrpZpsta对受体大豆品种吉农28的转化。2．利用PCR技术对经组织培养抗性筛选结果呈阳性的T0代再生植株进行初步检测，获得了T0代PCR检测呈阳性的植株7株，其中4株为chi基因PCR检测阳性，另外3株为chi和hrpZpsta双价基因PCR检测共阳性植株。T1代分子检测呈阳性的植株共27株，其中15株为chi基因阳性，12株为chi基因和hrpZpsta基因共阳性。3．利用Southern blot杂交技术对T1代植株进行双价外源抗病基因整合水平的检测，结果可知，外源双价抗病基因已成功转化至大豆受体品种基因组中，并在世代间遗传稳定，且分成单价和双价两种整合形式，从而获得了同时整合chi和hrpZpsta两种外源基因的转基因大豆植株。4．对T1代转化植株mRNA反转录产物进行实时荧光定量PCR检测，从而验证转化植株在双价基因转录水平的表达情况。根据检测结果可知：chi和hrpZpsta双价抗病基因在与植株核糖核酸RNA有关的转录水平上得到了高效的表达及稳定的遗传，两种广谱抗病基因chi和hrpZpsta在转基因植株中的相对表达量均显著高于受体品种中的相对表达量。

关键词： chi基因 hrpZpsta基因农杆菌介导法转基因大豆植株

农杆菌介导的chi和Glu基因转化黄瓜的研究

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农杆菌介导的Chi和Glu基因转化黄瓜的研究

作者：张国广华中农业大学

学位级别：硕士

黄瓜(Cucumis sativus L．)是葫芦科黄瓜属的蔬菜作物，在国内乃至世界范围内栽培面积较大。真菌病害的发生给黄瓜生产带来巨大的损失，制约了黄瓜的产量和品质的提高。植物基因工程的快速发展为抗性育种提供了一条崭新而有效的方... 详细信息

黄瓜(Cucumis sativus L．)是葫芦科黄瓜属的蔬菜作物，在国内乃至世界范围内栽培面积较大。真菌病害的发生给黄瓜生产带来巨大的损失，制约了黄瓜的产量和品质的提高。植物基因工程的快速发展为抗性育种提供了一条崭新而有效的方法。来源于菜豆的几丁质酶基因(chitinase gene，chi)，其蛋白质产物能够降解含几丁质的真菌细胞壁，抑制真菌生长。克隆自烟草的β-1，3-葡聚糖酶基因(β-1，3-glucanase gene，Glu)产物β-1，3-葡聚糖酶能够降解许多真菌菌丝暴露在表面的β-1，3-葡聚糖，从而抑制真菌的生长。本实验建立了稳定的黄瓜再生、转化体系，并将chi基因和Glu基因导入3个基因型的黄瓜基因组中。主要结果如下： 1．对于黄瓜离体再生芽的诱导，黄瓜萌发状念的幼嫩子叶在MS附加2.0 mg／L BA和1.0 mg／LABA的激素组合中再生最好。 2．新型激素TDZ对黄瓜离体外植体的不定芽诱导作用不明显，表现出较强的生长素活性，黄瓜子叶和下胚轴在MS附加有低浓度TDZ的培养基中迅速生根。 3．适量浓度的AgNO可以促进黄瓜离体子叶的再生，通常2.0 mg／LAgNO能发挥最好的效果，过量则抑制芽的再生。 4．在MS附加激素2.0 mg／L BA和1.0 mg／L ABA，并添加有2.0 mg／L AgNO时，津研四号和津研七号幼嫩子叶的不定芽诱导率分别为92.97％，82.43％，另一基因型绿霸春的幼嫩子叶芽的再生率为94.73％。 5．非转化子叶Km抗性测验表明：100 mg／L的卡那霉素完全抑制津研四号和津研七号的子叶再生，在此浓度下绿霸春产生极少的白化芽和畸形芽。 6．头孢霉素浓度在100～400 mg／L范围内对黄瓜子叶外植体不定芽诱导的抑制作用不明显。 7．烟草细胞悬浮系看护培养对黄瓜的遗传转化影响不明显。 8．对部分抗性植株提取DNA，经Multiplex PCR、Southern杂交检测证明，外源基因已整合入黄瓜基因组中。获得津研四号和津研七号转基因再生植株。 9．转基因植株田间接种试验表明，部分转基因黄瓜对霜霉病的抗性增强。

关键词：黄瓜 chi基因 Glu基因遗传转化抗病性