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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2021年第1期56卷 62-68页

作者：刘晨光余芳沁马润声张乐乐王美棋冯凯祥王涛殷德涛郑州大学第一附属医院甲状腺外科河南省临床医学重点学科开放实验室 450052

目的研究中心体蛋白cep63在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞系TPC-1凋亡过程中的作用及相关机制。方法收集PTC病例的癌组织和癌旁组织,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织cep63的表达情况并分析其与临床病理因... 详细信息

目的研究中心体蛋白cep63在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞系TPC-1凋亡过程中的作用及相关机制。方法收集PTC病例的癌组织和癌旁组织,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织cep63的表达情况并分析其与临床病理因素的关系。本实验随机分为阴性对照组(NC)、低表达组[cep63(-)]和过表达组[cep63(+)],将cep63慢病毒转染野生型TPC-1细胞系,并通过蛋白免疫印迹法(WB)和qRT-PCR验证cep63的干扰效果。通过平板克隆实验与MTT法检测细胞增殖能力变化;流式细胞术检测细胞的凋亡率,免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和WB检测转染前后细胞凋亡相关蛋白表达差异。2组间均数比较采用t检验,单因素方差分析进行多组间均数差异的比较,病理因素关联分析采用卡方检验。结果相比NC组,cep63(-)组细胞增殖受到抑制(3.18±0.07比2.14±0.09,t=8.54,Pcep63(+)组细胞的增殖能力明显提高(3.18±0.07比3.58±0.10,t=3.21,Pcep63(-)组和cep63(+)组凋亡率分别为3.03%±0.24%、8.66%±0.44%和1.17%±0.44%,流式结果表明cep63的低表达使TPC-1细胞的凋亡水平明显提高(F=157.7,Pcep63(-)组和cep63(+)组Bcl-2表达量分别为1.07±0.03、0.49±0.01和1.99±0.09,BAX表达量分别为0.64±0.02、1.06±0.01和0.21±0.03,WB结果表明,cep63的低表达使TPC-1细胞Bcl-2蛋白的表达量明显降低(F=183.2,Pcep63可能通过Bcl-2/BAX通路调控了PTC细胞系TPC-1的凋亡过程,cep63可能是PTC的一个潜在癌基因。

关键词：中心体 cep63 甲状腺肿瘤细胞凋亡

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cep63在甲状腺乳头状癌细胞中的作用及机制

Cep63在甲状腺乳头状癌细胞中的作用及机制

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作者：刘晨光郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的:甲状腺癌（thyroid carcinoma;TC）约占人类所有恶性肿瘤的1%,而在内分泌恶性肿瘤中所占比例高达90%。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是其中最常见的一类,占所有TC的70-80%,而且近年来PTC的发病率逐渐... 详细信息

背景和目的:甲状腺癌（thyroid carcinoma;TC）约占人类所有恶性肿瘤的1%,而在内分泌恶性肿瘤中所占比例高达90%。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是其中最常见的一类,占所有TC的70-80%,而且近年来PTC的发病率逐渐升高。大多数PTC经过外科切除术,TSH抑制治疗或联合放射性碘治疗能得到良好的治疗效果。但仍有少部分PTC恶性程度极高,带来比较严重的后果。一项研究表明,PTC的遗传改变是由癌基因的激活和抑癌基因的失活引起的。虽然在甲状腺癌中发现了许多遗传变异,但PTC的分子机制尚不清楚。因此,进一步研究PTC发生和发展的机理是十分必要的。中心体63号蛋白（Centrosomal protein 63,cep63）是中心体的前体,位于染色体3q22.2上,编码一个63kDa蛋白,有6个螺旋结构域;它以其结合cep152形成中心体环状结构基底的能力而闻名。既往研究发现,cep63在纺锤体失活后,参与纺锤体组装和DNA损伤,与中心体结合,调节有丝分裂,并引起染色体不稳定和畸变,导致预后不良,可能存在癌相关过表达。cep63已被证明可以促进肿瘤的发展和进化;然而,cep63与PTC发展之间的关系尚不明确。本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除cep63,阐明其对TPC-1细胞行为的影响。进一步研究了 cep63对TPC-1细胞中信号通路的影响。材料与方法:1.通过Western blotting检测人甲状腺癌细胞系TPC-1、FTC-133和正常甲状腺细胞系Nthy-ori-3中cep63在翻译水平的表达情况。采用qRT-PCR检测140对甲状腺乳头状癌组织及相对应的正常甲状腺组织中cep63的转录表达水平,并对cep63的表达水平与年龄、性别、淋巴结转移、病理分期的情况进行相关性分析。2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TPC-1细胞中的cep63基因,构建cep63-KO稳定传代细胞系,通过Western blotting和qRT-PCR检验cep63的敲除效率。通过CCK-8和平板集落形成实验检测cep63基因敲除对TPC-1细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术检测cep63对TPC-1细胞周期和凋亡能力的影响;通过细胞划痕实验、transwell实验检测cep63对细胞侵袭和迁移能力的影响。3.检测cep63与JAK/STAT3和AKT/ERK信号通路的关系,通过Western blotting检测TPC-1和cep63-KO细胞中相关通路蛋白的表达水平,通过JAK抑制剂LY2784544处理,进一步检测通路在细胞中的作用。4.通过裸鼠皮下成瘤试验检测TPC-1和cep63-KO细胞在体内增殖能力的差异,并记录瘤体体积以及鼠重的变化,最后处死老鼠后剥离瘤体并称量瘤重,评估两组细胞在体内成瘤效果的差异。将细胞及小鼠瘤体进行免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）,检测相关蛋白的表达情况。结果:***63在PTC组织中的表达明显高于正常甲状腺组织;与正常甲状腺Nthy-ori-3细胞相比,cep63在TPC-1细胞中明显上调。通过分析cep63表达水平和临床病理特征之间的关系,发现cep63高表达与淋巴结转移有显著的相关性,而患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、BRAF突变状态与cep63表达水平无相关性。2.通过CRISPR/Cas9技术敲除cep63基因,抑制其在细胞的表达,RT-PCR和Western blotting结果显示cep63在细胞中表达缺失。CCK-8与平板克隆实验结果显示,cep63-KO细胞的增殖能力和克隆形成能力明显降低;流式细胞术结果显示,与TPC-1细胞相比,cep63-KO细胞G0/G1期比例明显减少,S期比例明显增多,细胞从G0/G1期向S期过渡明显增加,cep63-KO细胞的凋亡率明显高于TPC-1细胞（20.1%、2.0%）。细胞迁移和侵袭实验结果显示,与TPC-1细胞相比,cep63基因敲除后细胞迁移率降低了 25.31%,cep63-KO细胞穿透transwell 膜的数量明显低于 TPC-1 细胞（147.0±10.12 和 226.3±11.89）。3.与TPC-1组相比,cep63-KO组的p-JAK和p-STAT3蛋白表达水平分别降低了 19.3%和39.4%。JAK抑制剂LY2784544处理后,TPC-1细胞中p-JAK和p-STAT3蛋白表达水平分别降低20.0%和15.6%。与TPC-1组相比,cep63-KO组AKT、ERK和CDK1蛋白表达水平明显降低（分别为77.8%、22.3%和66.9%）。凋亡蛋白BAX表达明显上调,Bcl-2表达受到显著抑制。4.动物

关键词： cep63 PTC 增殖侵袭 JAK/STAT3

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5个膀胱癌相关基因片段的DNA拷贝数改变及其意义

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癌变．畸变．突变 2015年第2期27卷 91-94,100页

作者：郗昊陈皇柏景乔郑阳寿建忠刘宇程书钧高燕宁北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院癌发生及预防分子机理北京市重点实验室分子肿瘤学国家重点实验室病因及癌变研究室北京100021 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院泌尿外科北京100021

目的:探究本实验室前期工作发现的膀胱癌患者肿瘤组织中DNA拷贝数高频率改变的5个基因片段是否为中国(汉族)人膀胱癌特征性的异常改变。方法:针对上述5个DNA片段:cep63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3,采用实时荧光定量PCR技术,分析比较它... 详细信息

目的:探究本实验室前期工作发现的膀胱癌患者肿瘤组织中DNA拷贝数高频率改变的5个基因片段是否为中国(汉族)人膀胱癌特征性的异常改变。方法:针对上述5个DNA片段:cep63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3,采用实时荧光定量PCR技术,分析比较它们在白种人来源的商品化基因组DNA、30例健康中国汉族人外周血白细胞、51例膀胱癌患者肿瘤组织及配对的外周血白细胞的基因组DNA样品中拷贝数改变的情况。结果:除ZFAND3外,另外4个基因在白种人商品化基因组DNA与中国健康人外周血白细胞样品之间均存在DNA片段拷贝数差异。与中国健康人外周血白细胞相比,膀胱癌患者肿瘤组织中cep63、GHR和PAQR6 DNA片段拷贝数均增加(P均0.05);膀胱癌患者的外周血白细胞样品中cep63和PAQR6拷贝数均增加(P均cep63、FOSL2、GHR和ZFAND3拷贝数均增加(P均cep63、FOSL2、GHR和PAQR6在中国汉族人与白种人之间存在DNA片段拷贝数差异。在汉族人中,cep63、GHR基因片段的拷贝数增加很可能是在膀胱癌发生发展过程中获得的基因异常改变;而PAQR6拷贝数增加则可能是膀胱癌患者所携带的遗传变异。

关键词：膀胱癌 DNA拷贝数 cep63 FOSL2 GHR PAQR6 ZFAND3

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