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基因组学与应用生物学 2017年第7期36卷 2874-2879页

作者：党会杰刘秦许文茸张传玲王森涂鲁迪牛晓磊海南大学热带农林学院海口570228 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室海口570228 海南大学材料与化工学院海口570228

PCR片段快速准确的构建到克隆载体是分子生物学实验的关键技术之一。快速高效低背景克隆体系的建立可以显著提高PCR产物的克隆效率及大大缩短克隆时间。本实验室开发出一种在常规条件下进行快速高效PCR连接的克隆体系。本研究将含有ccd ... 详细信息

PCR片段快速准确的构建到克隆载体是分子生物学实验的关键技术之一。快速高效低背景克隆体系的建立可以显著提高PCR产物的克隆效率及大大缩短克隆时间。本实验室开发出一种在常规条件下进行快速高效PCR连接的克隆体系。本研究将含有ccd B致死基因的gateway cassette片段,插入p UC18载体,成功构建p UC18-Ccd B致死载体,在此基础上结合ccd B致死基因内部的SmaⅠ酶切位点,开发出将PCR产物、SmaⅠ限制性内切酶、T4连接酶及p UC18-Ccd B致死载体一起加入离心管后共孵育10 min,即可转化大肠杆菌。对插入片段的重组质粒进行了酶切,PCR和测序验证,证实了该克隆体系高效可行,具有极高的阳性克隆率。该体系的建立具有高效低背景的特点,并且极大的减少了克隆步骤,省去了胶回收及双酶切过程,缩短了克隆时间,同时继承了p UC18载体的优点,具有很强的应用性及推广性。

关键词：快速高效克隆体系 ccdb基因 SmaⅠ酶切位点

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重组工程介导的基因突变以及新型的容纳毒性基因ccdb菌株的构建

重组工程介导的基因突变以及新型的容纳毒性基因ccdB菌株的构建

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作者：严振亚南京师范大学

学位级别：硕士

重组工程是一种高效的适用于体内遗传工程的方法,能适用于大肠杆菌染色体和游离型复制子,可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰而无需受到限制性内切酶位点的制约,通过重组工程很容易获得基因敲除、点突变和基因标签的插入,是大肠杆菌... 详细信息

重组工程是一种高效的适用于体内遗传工程的方法,能适用于大肠杆菌染色体和游离型复制子,可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰而无需受到限制性内切酶位点的制约,通过重组工程很容易获得基因敲除、点突变和基因标签的插入,是大肠杆菌中基因功能研究的主要方法,具有操作简单、周期短、重组效率高等特点。定点突变技术是在已知DNA序列中任意地插入、取代或移除DNA片段,对靶DNA分子引入特异性改变可以快速高效地改善靶蛋白的表达特性,是研究基因工程和蛋白工程的有效的工具。现如今市场上常用的点突变方法有PCR介导的定点突变、寡核苷酸引物介导的定点突变和盒式突变,这些方法存在周期长或成本高的问题。本论文提出一种新的点突变技术,利用PCR引入突变位点,再由重组工程实现突变位点取代目标质粒上的待突变位点。以质粒pLS122为例,对质粒上的nanA基因进行S208G.E192N点突变和E192点饱和突变实验。MMR（Mismatch repair）系统中的mutH, mutL基因编码的蛋白是错配修复系统中的特异性蛋白,修复复制过程中产生的碱基错配,同样的mutT, uvrB和ung基因所编码的蛋白可能会纠正重组时突变位点的错配,影响突变效率,故而本研究尝试敲除以上有关基因来提高重组突变效率。通过敲除mutH、mutL、mutT、uvrB和ung后,突变效率仍为50%,没有显著提高。突变片段5’端磷硫酰修饰可减少菌体内DNA酶对突变片段的降解,以提高重组效率来获得更多正确的突变菌株,然而结果表明突变片段5’端的修饰使得突变效率降低至20%左右。此外,同源重组效率跟同源臂长度有关,因此本研究通过延长突变片段一侧的同源臂长度来提高重组效率,最后发现一侧长同源臂的突变片段和pLS122以1：1的摩尔比共转化重组菌株后,突变效率提高到75%。E192点饱和突变实验仅得到15种其它氨基酸的突变密码子。重组工程介导的基因突变周期短,操作过程简便,如能进一步提高突变效率,则有可能广泛使用于点突变等研究。ccdb基因编码的ccdb蛋白对大肠杆菌有强致死性,该特性使得ccdb基因可用于克隆转化或重组时的筛选标记。含ccdb和R6K复制子的克隆可在E. coliDB3.1 λpir中存在,但在E. coli DB3.1 λpir中以R6K为复制子的克隆为低拷贝,并且转化效率较低,.不利于作为以R6K为复制子的克隆的转化宿主菌株。因而本研究从E. coli BUN20出发,将E. coli BUN20的GyrA蛋白的第462位精氨酸突变为半胱氨酸,得到一种新型的可容纳ccdb的E. coli BUN20的GyrA462突变菌株,LS027,该GyrA462突变菌株可以有效地抵抗ccdb的毒性,经验证转化效率约6.9×108/μg,比E. coli DB3.1 Xpir的转化效率提高了100倍,同时因为含有pir的突变体pir116基因,R6K质粒表现为高拷贝,.克隆拷贝数增加至每细胞200个,这种能更好地容纳ccdb基因的新型菌株将会普遍应用于ccdb相关的克隆构建中。

关键词：重组工程点突变重组效率 ccdb基因

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利用毒素蛋白基因ccdb构建高效低背景T-载体

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热带生物学报 2016年第2期7卷 232-236页

作者：耿晓姗刘秦党会杰武军政罗丽娟海南大学农学院海口570228 海南大学海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地海口570228

高效低背景T-载体的构建可显著提高克隆PCR产物的效率。笔者介绍1种在实验室常规条件下简单快捷制备高效低背景T载体的方法。将含有限制酶Xcm I酶切位点的ccd B致死基因作为插入DNA片段连接到p MD19-T Simple Vector骨架上得到重组质粒... 详细信息

高效低背景T-载体的构建可显著提高克隆PCR产物的效率。笔者介绍1种在实验室常规条件下简单快捷制备高效低背景T载体的方法。将含有限制酶Xcm I酶切位点的ccd B致死基因作为插入DNA片段连接到p MD19-T Simple Vector骨架上得到重组质粒,通过菌落PCR、酶切分析及测序验证正确的重组质粒经限制酶Xcm I酶切即得到T-载体。该T-载体含有的ccd B致死基因可以降低载体自连的背景干扰,提高了T-A克隆效率,具有较高的阳性克隆率,继承了p MD19-T Simple Vector的优点,与普通T-载体相比,还具有高效、低背景的优越性。整个操作过程简易可行,具备一定的应用前景。

关键词：高效低背景 ccdb基因 pMD19-T Simple Vector T-载体

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基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

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山东第一医科大学（山东省医学科学院）学报 2023年第3期44卷 180-185页

作者：杜雅婷于文君李燕付元磊孙考祥烟台大学药学院山东烟台264000 烟台药物研究所山东烟台264000 烟台新药创制山东省实验室中科环渤海(烟台)药物高等研究院山东烟台264000

目的基于Golden Gate技术构建psiCHECK-ccdb重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增ccdb致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-ccdb。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-ccdb载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-ccdb重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受ccdb毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKccdb载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论本研究成功构建了psiCHECK-ccdb重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

关键词： Golden Gate ccdb基因双荧光素酶报告基因分子克隆 RNAi药物筛选

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新型重组工程负筛选标记的建立和N-乙酰-D-神经氨酸酶催化菌株的优化

新型重组工程负筛选标记的建立和N-乙酰-D-神经氨酸酶催化菌株的...

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作者：张青南京师范大学

学位级别：硕士

重组是同源重组介导的基因工程,通过生物体内诱导产生的同源重组酶进行,是一种高效的适用于体内遗传工程的方法,不受连接酶和限制性核酸内切酶的限制,可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰,在基因敲除、点突变等方面有广泛的应用,具有... 详细信息

重组是同源重组介导的基因工程,通过生物体内诱导产生的同源重组酶进行,是一种高效的适用于体内遗传工程的方法,不受连接酶和限制性核酸内切酶的限制,可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰,在基因敲除、点突变等方面有广泛的应用,具有操作简单、快速高效等优点。负筛选标记是针对作为正选择标记的抗生素抗性基因而言的,含有此基因时不能存活的一种基因类型,广泛运用于基因克隆和DNA修饰。本论文提出了一种新型重组工程介导的诱导型ccdb基因的负筛选方法,据报道,与galK、thyA、sacB、tolC等负筛选标记相比,来源于F质粒、作用于DNA拓朴异构酶Ⅱ而呈现毒性的ccdb基因筛选效率最为高效。在实验中,我们选择抗生素抗性基因和诱导型cccdb基因联合使用, plac启动子置于ccdb之前使得在IPTG诱导下表达ccdb,诱导型ccdb基因作为负筛选标记,只需要加入诱导剂便可得到筛选,还可以实现对不具有耐受ccdb毒性蛋白的菌株的修饰。以大肠杆菌DH10B基因组上lacZ基因的敲除为例说明,通过PCR引入50bp的同源臂,构建HA1-aacC1-plac-ccdb-HA2的基因盒,与目的基因发生同源重组,在庆大霉素抗性筛选之下获得含有诱导型ccdb基因的突变菌株,然后利用ccdb作为筛选标记,成功获得含有mKan、 bla*目的菌株和无痕敲除的菌株。在诱导型ccdb基因的筛选下,分别将pir116基因和重组酶基因成功敲入到DH10B的lacZ区域,pirll6基因能有容纳R6K复制子的质粒,并且使其呈现高拷贝,不再仅仅局限于BUN20作为宿主菌。重组酶基因存在于突变菌株的基因组上,直接加入L-阿拉伯糖诱导重组酶表达,实现线性DNA片段间的同源重组,或实现线性DNA与环状质粒的同源重组,操作简单高效。将I-Scel基因成功敲入到MG1655的uidA区域,重组效率达到67.5%,I-SceI酶能够介导双链断裂修复,相对于质粒水平,将I-SceI基因敲入到基因组水平上比在质粒水平上更加稳定的存在与表达,对同源重组中抗性筛选标记的敲除具有重大意义。N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)以及其衍生物是非常重要的生物分子,这些糖分子往往处于大分子物质的末端,具有重要的生物学功能和医用价值。在合成Neu5Ac的方法中,全细胞催化法合成Neu5Ac的方法因其具有操作简单,成本低,环保等优点而广受欢迎。实验中在菌株LS2802的基础上,利用Red重组工程对菌株进行优化,将降低胞内GlcNAc的有关基因nagABE、manXYZ、fucIK成功敲除,阻断代谢途径,将有利于生成Neu5Ac有关的基因glmS*72、ScGNA1整合到同一基因组上共表达,获得了一系列生产神经氨酸的菌株。

关键词：重组工程负筛选 ccdb基因 Neu5Ac

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