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生防假单胞菌FD6的定殖能力及cbra/b双组分调控系统功能鉴定

生防假单胞菌FD6的定殖能力及CbrA/B双组分调控系统功能鉴定

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作者：刘银银扬州大学

学位级别：硕士

许多对植物有益的假单胞菌已被鉴定为植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),这类微生物通常具有代谢多样性,可以保护植物免受病原物侵害以及促进植物的生长,且上述能力和它们在根际竞争定殖能力密切相关。防御假... 详细信息

许多对植物有益的假单胞菌已被鉴定为植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),这类微生物通常具有代谢多样性,可以保护植物免受病原物侵害以及促进植物的生长,且上述能力和它们在根际竞争定殖能力密切相关。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6是本课题组持续多年研究的一株优良生防细菌,前期主要围绕抗菌活性物质的合成调控进行深入研究,尚不清楚其定殖特点。基于此,本研究利用盆栽试验测定了菌株FD6定殖能力,结果表明,FD6均能有效定殖于小麦、番茄和黄瓜的根部及根围,在黄瓜根部定殖量最大,其次是番茄和小麦,且在番茄和黄瓜中根尖定殖量显著高于根际土壤。采用灌根和浸种两种接种方式对细菌在小麦和番茄根部定殖量均没有显著影响,在灌根处理下番茄根际定殖量显著高于浸种的处理方式,可达到105 CFU/g。此外,FD6可有效定殖于根基部、根中部和根尖,且在根尖的定殖量显著高于根基部,综上,FD6定殖能力强且能有效定殖于多种植物根部。根际细菌的定殖能力通常受到很多基因的调控,根据文献报道,从防御假单胞菌FD6基因组中搜索到88个保守的定殖相关基因,这些基因主要参与碳水化合物代谢以及氨基酸代谢和转运。其中,双组分调控系统cbra/b主要参与碳和氮源代谢,也可能影响细菌定殖能力。因此,本论文深入解析cbra/b在生防细菌FD6中的作用。防御假单胞菌FD6可产生多种次生代谢产物,通过温室盆栽试验,以商品化的药剂20%噻唑锌悬浮剂为阳性对照,检测FD6及其衍生菌株对番茄青枯病的防治效果。结果显示,FD6对青枯病的防治效果与化学药剂相当,接种青枯菌两周后FD6防效可达到78.86%;cbra、cbrb基因突变后,对青枯病的防效显著下降。以试管苗为研究体系,当cbra、cbrb和cbrab双突变后,三种突变体在番茄根部定殖能力均受到影响,回补菌可部分恢复定殖能力。接种7天后,三种突变体在番茄根部的竞争定殖能力显著下降,仅为与野生型种群数量的一半,可见,cbra、cbrb正调控FD6的定殖及竞争定殖能力。定殖相关生物学表型结果显示,cbra、cbrb突变导致细菌运动能力减弱,形成生物膜的能力增强。我们同时还测定了 cbra和Cbrb对抗生素合成的影响,HPLC数据显示,cbra、cbrb的突变导致藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin,PLT)和2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetyphloroglucinol,2,4-DAPG或PHL)产量显著下降。qRT-PCR检测缺失菌与野生型菌株中2,4-二乙酰基间苯三酚和藤黄绿脓菌素合成调控基因的表达量,结果表明:cbra和cbrb的缺失后PLT、2,4-DAPG的合成基因pltL、phlA表达量均显著下降。通过测定转录融合结构β-半乳糖甘酶的活性,结果进一步证实,cbra/b在转录水平正调控这两种抗生素合成。Cbrb是一个依赖于σ54 RNA聚合酶的转录激活蛋白,属于NtrC家族的反应调节子。可以特定地结合2到3个非回文序列,间隔为12-16个核苷酸。根据文献报道的保守功能域搜索FD6基因组寻找Cbrb可能结合的靶基因,得到三个可能影响细菌定殖能力的基因,分别是参与鞭毛组装与运动性有关的基因flgb、生物膜形成相关基因algD和位点特异性重组酶相关基因DWF746010,通过细菌单杂交试验证实Cbrb可与flgb、algD和DWF746010这3个基因的启动子区结合。以pET22b(+)为原核表达载体,bL21为宿主菌,成功表达了与His标签蛋白融合的Cbrb重组蛋白,其中大部分以可溶性蛋白的形式存在,分子量大小约为52kDa。当用浓度为200mM的咪唑洗脱液洗脱时,可以得到高纯度的Cbrb蛋白,浓缩后蛋白浓度为0.546 mg/mL,可用于后续EMSA验证试验。综上所述,Pseudomonas protegensFD6中cbra/b对细菌定殖能力、运动性、抗生素的合成和生物膜形成具有多效调控作用,且Cbrb通过结合flgb、algD和DWF746010基因的启动子区影响细菌的定殖能力,这三个基因对定殖的调控机制还需要进一步研究。

关键词： PGPR Pseudomonas protegens FD6 定殖能力 cbra/b双组分系统

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