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cathepsin c在髓鞘再生中的功能角色

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Cathepsin C在髓鞘再生中的功能角色

作者：易善松大连医科大学

学位级别：硕士

背景:在中枢神经系统中,少突胶质细胞延伸出膜样突起紧紧包裹缠绕轴突形成髓鞘。在髓鞘节段之间轴突裸露的部分称为朗飞氏结,神经冲动在郎飞氏结间跳跃式传导从而加快了传导速度。髓鞘还为轴突提供物理保护和营养支持的功能。多发性硬化... 详细信息

背景:在中枢神经系统中,少突胶质细胞延伸出膜样突起紧紧包裹缠绕轴突形成髓鞘。在髓鞘节段之间轴突裸露的部分称为朗飞氏结,神经冲动在郎飞氏结间跳跃式传导从而加快了传导速度。髓鞘还为轴突提供物理保护和营养支持的功能。多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统最常见的脱髓鞘疾病,目前缺少有效的治疗方法,是神经系统难以治愈的疾病。MS的病理学特征包括炎症、血脑屏障的破坏、髓鞘脱失和轴突变性。多数MS患者早期,破坏的髓鞘通过再生再生修复,使症状得到缓解。然而,随着持续的脱髓鞘,髓鞘再生过程逐渐失败,出现轴突退化,最终导致神经元的丢失。神经元丢失可能是MS患者致残的根本原因。因此,促进髓鞘再生是改善和治疗MS的有效策略,而研究髓鞘再生的机制对于寻找新的治疗靶点具有非常重要的意义。我们在前期研究中发现,组织蛋白酶c(cathepsin c,cat c)在中枢神经系统炎症和脱髓鞘疾病中表达显著增加。而且在小鼠脱髓鞘模型中,cat c过表达通过增加中枢神经系统的炎性细胞浸润,从而加重了髓鞘的损害。然而cat c在髓鞘再生中的作用我们并不清楚。目的:探究cat c在脱髓鞘疾病中对髓鞘再生功能的影响及其分子机制。方法:利用c57BL/6J野生型(wild type,WT)、cat c过表达(cat c over expression,cat c OE)和cat c敲减(cat c knock down,cat c KD)的小鼠,使用脑立体定位仪注射2μl的1%溶血卵磷脂(lysolecithin,LPc)至小鼠胼胝体小钳(the forceps minor of the corpus callosum,fmi),诱导局灶性脱髓鞘模型。WT小鼠注射2μl的PBS作为对照。在LPc注射第7天和14天取材。利用免疫组织化学的染色方法观察比较脱髓鞘区域少突胶质细胞(cc1)的数目和小胶质细胞(Iba-1)活化的情况;利用电镜技术观察并分析G-ratio比值(轴突直径/髓鞘总直径),比较脱髓鞘区域髓鞘再生情况;利用Real-time PcR的方法观察比较脱髓鞘区域促炎性因子TNF-α和IL-1β的表达情况;利用少突胶质细胞前体细胞标志物PDGFR-α免疫荧光和胸腺嘧啶核苷类似物(5-Ethynyl-2-deoxyuridine,EdU)双染色的方法观察比较少突胶质细胞前体细胞的增殖情况。采用单因素方差分析的方法对实验数据进行统计分析,当Pc注入14天时,cat c OE组小鼠脑脱髓鞘区域的少突胶质细胞数目显著低于野生型和cat c KD组小鼠的少突胶质细胞数目。2.在LPc注射14天时,cat c OE组小鼠脑脱髓鞘区域的G-ratio比值显著高于野生型和cat c KD组小鼠的比值。3.在LPc注射7天和14天时,cat c OE组小鼠脑脱髓鞘区域的小胶质细胞数目都显著高于野生型和cat c KD组小鼠的小胶质细胞数目。4.在LPc注射7天和14天时,cat c OE组小鼠脑脱髓鞘区域的促炎性因子TNF-α和IL-1β的表达都显著高于野生型和cat c KD组小鼠的表达。5.在LPc注射14天时,cat c OE组小鼠脑脱髓鞘区域的增殖的少突胶质细胞前体细胞数目显著低于野生型和cat c KD组小鼠的增殖数目。结论:cat c基因过表达增强LPc诱导的脱髓鞘模型中脱髓鞘区域小胶质细胞活化以及促炎性因子TNF-α和IL-1β的表达而导致了髓鞘再生迟滞。

关键词：髓鞘再生 cathepsin c 溶血卵磷脂小胶质细胞少突胶质细胞前体细胞

cathepsin c调节辅助性T细胞分化加重MOG35-55诱导的实验性变态反应性脑脊髓炎

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Cathepsin C调节辅助性T细胞分化加重MOG35-55诱导的实验性变态反...

作者：刘双大连医科大学

学位级别：硕士

背景:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统(central nervous system,cNS)自身免疫性脱髓鞘疾病,其主要病理改变包括髓鞘脱失、轴突损伤、胶质细胞活化和神经炎症反应等,机制不清,具有反复发作、多部位损害和影响神经... 详细信息

背景:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统(central nervous system,cNS)自身免疫性脱髓鞘疾病,其主要病理改变包括髓鞘脱失、轴突损伤、胶质细胞活化和神经炎症反应等,机制不清,具有反复发作、多部位损害和影响神经功能等特征,固有免疫和适应性免疫应答异常是诱发该疾病的主要原因。MS早期,外周免疫细胞异常激活,并通过破坏的血脑屏障(blood brain barrier,BBB)进入cNS,产生大量促炎因子和趋化因子,活化cNS中的免疫细胞—小胶质细胞(microglia,MG),引发cNS炎症。同时,进一步趋化外周更多T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell,Dc)等免疫细胞浸润,产生针对髓鞘相关蛋白的异常自身抗体,发生一系列针对髓鞘的病理改变。组织蛋白酶c(cathepsin c,catc)属于溶酶体番木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶,是一种分泌性的外切酶,具有独特的二肽肽酶活性,主要表达在淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞等免疫相关细胞中,参加蛋白质降解、蛋白质加工、抗原呈递、细胞凋亡以及肿瘤浸润和炎症反应等。生理条件下cNS中catc主要在海马齿状回caⅡ区、嗅球等区域的神经元表达。在我们前期研究中发现,病理条件下catc可在活化的MG中表达,并可通过自分泌和旁分泌促进MG和巨噬细胞向M1极化,从而加重神经炎症及cuprizone诱导模型的髓鞘脱失。然而,catc在适应性免疫应答中的作用至今不清。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)是位于cNS髓鞘最外层的蛋白成分。MOG诱导的实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是利用MOG的35-55肽段免疫动物,诱发免疫反应和髓鞘脱失,与MS具有非常相似的免疫机制,主要表现为:(1)均针对cNS髓鞘蛋白产生免疫攻击;(2)活化的T细胞均包含辅助性T(helper T,Th)细胞;(3)导致病理改变的淋巴细胞均为产生干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素12(interleukin 12,IL-12)的Th1细胞和产生IL-17、IL-23、IL-1β的Th17细胞。因此,EAE是国际上公认的研究MS免疫机制的最佳模型。除上述致病淋巴细胞外,Treg和Th2可以抑制Th1和Th17的活动,控制炎症反应;而与生发中心(germinal center,Gc)形成、B细胞成熟及抗体产生相关的滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cell,Tfh)也日趋得到重视。目的:探讨catc对EAE模型神经功能的影响及其相关免疫机制方法:利用c57BL/6J野生型(wild type,WT)和catc过表达(catc over expression,catc OE)的小鼠,建立MOG诱导的EAE脱髓鞘模型,正常c57BL/6J小鼠为空白对照。自免疫当天开始,每天对小鼠称重,观察小鼠状态,并按照EAE模型临床评分标准进行神经功能评分,连续观察48天。在免疫后第7、10、15、23和50天分别提取各组小鼠的脾和引流淋巴结以及血清。利用流式细胞术的方法分析脾脏和淋巴结Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh细胞分化情况;利用酶联免疫吸附实验的方法观察血清内Tfh和T17h相关细胞因子IL-21和IL-17,以及MOG特异性的Ig G抗体的表达情况。采用单因素方差分析和t检验的方法对实验数据进行统计分析,数据用Mean±SEM表示,Pcatc OE加重神经功能损伤。与野生型相比,MOG免疫后catc OE小鼠发病时间早;神经功能评分无论在急性期(23天)和慢性持续阶段(48天)显著增高,说明catc加重EAE神经损害。2.catc OE增加了EAE模型动物脾脏和颈部引流淋巴结中cD4+Th细胞中Th17和Tfh细胞的比例及血清中相关细胞因子IL-17A和IL-21表达。与野生型相比,MOG免疫后catc OE小鼠脾脏和颈部引流淋巴结中的Th17和Tfh细胞在免疫后第7、10和15天时均显著增高,并伴有血清中的IL-17A和IL-21表达的显著增高;Treg细胞在免疫后第7、10和23天时均显著增高;而Th1和Th2细胞无显著性差异。3.catc OE促进MOG-特异性Ig G抗体表达显著升高。与野生型相比,MOG免疫后catc OE小鼠血清里的MOG-特异性Ig G抗体在第10,14和23天显著升高。结论:catc促进cD4+T细胞向Th17和Tfh细胞分化,并促进其相关细胞因子IL-17和IL-21的表达以及增加MOG-特异性Ig G抗体的产生,从而加重EAE疾病进展。

关键词：多发性硬化实验性变态反应性脑脊髓炎 cathepsin c Tfh Th17

小胶质细胞内cathepsin c差异表达对LPS介导的小鼠学习记忆功能障碍的影响

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小胶质细胞内cathepsin C差异表达对LPS介导的小鼠学习记忆功能障...

作者：肖洪亮大连医科大学

学位级别：硕士

目的：研究表明,中枢神经系统(central nervous system,cNS)的神经炎症性反应参与多种记忆障碍性疾病的发病及其发展过程,如阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、血管性痴呆、皮质下动脉硬化性脑病、腔隙性脑梗塞及术后认知功能障碍(po... 详细信息

目的：研究表明,中枢神经系统(central nervous system,cNS)的神经炎症性反应参与多种记忆障碍性疾病的发病及其发展过程,如阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、血管性痴呆、皮质下动脉硬化性脑病、腔隙性脑梗塞及术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POcD)等。但是目前神经炎症反应在学习记忆障碍中的作用机制仍然不清楚。我们在以往的研究中发现,组织蛋白酶c(cathepsin c, cat c)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的神经炎症模型小鼠的小胶质细胞内表达增强,并且酶活性上调。但目前尚未对cat c的功能和意义作进一步研究。本研究旨在阐明小胶质细胞内cat c表达对LPS介导的cNS神经炎症以及对小鼠学习记忆功能的影响。方法：本研究分别对c57BL/6J野生型(WT)、cat c基因低表达(knock down, KD)和cat c基因过表达(over expression, OE)小鼠进行低剂量LPS(100μg/kg)腹腔注射。注射前和注射28小时后,采用Morris水迷宫实验对小鼠学习与记忆功能进行检测：采用Iba-1免疫组化染色,对脑内小胶质细胞的活化情况进行观察：通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法对外周血清和脑内炎性因子TNF-α和IL-γ的表达情况进行检测。采用重复测量数据的多因素方差分析与单因素方差分析法,对实验数据进行统计学分析,比较各组间差异。结果：LPS腹腔注射28小时后,水迷宫行为学检测发现0E小鼠出现学习记忆功能障碍,而WT和KD小鼠学习记忆能力在LPS注射前后无明显变化。Iba-1免疫组化染色显示LPS注射后,WT、OE和KD小鼠大脑皮质和海马区小胶质细胞的活化,血清和脑组织中炎性因子TNF-α和IL-1β的表达增加,其中OE小鼠小胶质细胞处于明显活化状态,血清和脑组织中TNF-α和IL-1β的表达量显著高于WT小鼠,KD小鼠血清和脑组织中TNF-α和IL-1β的表达量显著低于WT小鼠。结论：小胶质细胞内cathepsin c过表达促进了LPS注射小鼠血清和脑内炎性因子产生,诱导了脑内小胶质细胞活化,从而加剧了脑内炎症反应,这可能是cNS神经炎症小鼠学习记忆障碍发生的重要因素之一

关键词： cathepsin c 脂多糖学习记忆神经炎症基因调控

实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立及cathepsin c在急、慢性期模型中的表达

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实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立及Cathepsin C在急、慢性期...

作者：范斌大连医科大学

学位级别：硕士

目的：建立少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55（myelin oligodendrocyteglycoprotein,MOG35-55)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠模型，研究cathepsin c在急性和慢性期EAE模型中的表达。方法：1.EAE小鼠模型的建立:成年c57BL/6雌性小鼠，采用MOG35-55多肽与完全弗氏佐剂（Freund’s adjuvant complete，cFA）混合的乳化抗原皮下注射免疫，并腹腔注射百日咳毒素建立EAE模型，正常c57BL/6小鼠作为空白对照组，用不含有MOG多肽的混合乳剂作为实验对照组。注射后观察各组小鼠体重变化，并根据小鼠行为学改变进行临床评分。2.组织病理学检测：HE染色观察中枢神经系统(central nervous system，cNS）炎症细胞浸润;髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）免疫组化染色和Black Gold髓鞘染色观察髓鞘脱失情况;Iba-1和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）免疫组化染色分别观察小胶质细胞活化和中性粒细胞浸润情况。3.cathepsin c表达及细胞定位：于MOG诱导模型建立后的第21天(急性期)和第41天（慢性期），利用免疫组化染色检测cathepsin c在脑和脊髓中的表达;cathepsin c原位杂交染色后进行MPO和Iba-1免疫组化染色，确定cathepsin c的细胞定位。结果：1.MOG诱导模型小鼠一般状态及行为学评分MOG诱导组小鼠于免疫后平均10.3±1.58天开始出现精神萎靡，体重下降，尾部张力消失，继而出现后肢无力、后肢瘫痪等症状。临床症状平均评分为1.7±0.9分，21天症状最为严重，此后症状持续，无明显缓解。实验对照组与空白对照组均未发现体重明显减轻和行为异常。2.组织病理学检测（1）HE染色显示：急性期和慢性期小鼠脑和脊髓组织中均出现以白质受累为主的神经炎症性病理改变：炎性细胞浸润，扩张的小血管周围形成“袖套”样改变，急性期较慢性期明显。（2）MBP免疫组化与Black Gold的髓鞘染色显示：急性期EAE小鼠脑区未见明显髓鞘脱失，脊髓区域出现片状髓鞘脱失。慢性期EAE小鼠的脑和脊髓均有脱髓鞘改变。（3）MPO和Iba-1免疫组化染色显示：在脑和脊髓组织的炎性浸润及髓鞘脱失区域周围，可见中性粒细胞浸润及小胶质细胞的集聚与活化。实验对照组和空白对照组没有发现中性粒细胞浸润和小胶质细胞的改变。3.cathepsin c表达及细胞定位：实验对照组和空白对照组小鼠cathepsin c的表达仅限于海马cAII区神经元，其他脑区未发现阳性表达。在EAE模型中，cathepsin c在脑和脊髓组织中髓鞘脱失区域有明显阳性表达。cathepsin c原位杂交后MPO和Iba-1的免疫组化双染显示：cathepsin c在急性EAE模型脑和脊髓的小胶质细胞和中性粒细胞均有表达，在慢性期主要由中性粒细胞表达。结论：1.本研究MOG35-55诱导小鼠EAE模型成功，中枢神经系统神经炎症和髓鞘脱失呈持续性，无明显缓解期。2.cathepsin c在急、慢性期EAE模型中表达增强，可能参与cNS炎症反应及髓鞘脱失。

关键词： cathepsin c 实验性自身免疫性脑脊髓炎模型少突胶质细胞糖蛋白

cytokines induce the expression and activity of cathepsin c in microglia in LPS-induced neuroinflammation

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Cytokines induce the expression and activity of cathepsin C ...

cathepsinc在小鼠脱髓鞘模型中的表达及其临床意义初步探讨

中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五次会员代表大会

作者： Kai FAN~1,Bin FAN~2,Jian-Mei MA~(1,*) 1 Anatomy department of Dalian Medical University,Dalian 116044,china 2 Graduate school of Dalian Medical University,Dalian 116044,china

Objective Neurodegenerative diseases accompany neuroinflammatory pathological process,during which injury or loss of neurons often occurs.As a result,cognition,learning or movement function is severely impaired.So far,the mechanism concerned is unclear.cathepsin c(also called dipeptidyl peptidase,DPPI),a lysosomal cysteine protease,activates granule-associated serine proteases which play important roles in host reponses to bacterial infection in periphery tissues.However,whether cathepsin c participates in regulation of the process of inflammation in cNS remains unknown.The present study is to explore the role of cathepsin c in cNS inflammatory process.Methods An acute inflammation mice model was established by LPS(25 mg/kg,b.w.) intraperitoneally single injection.At different time points after LPS injection,the cellular localization,expression pattern and level of cathepsin c was detected by immunohistochemistry and Western blotting.The expression of cathepsin c mRNA, IL-1βmRNA and TNFa mRNA were studied by in situ hybridization and RT-PcR.In vitro,BV mouse microglia lines were treated with various concentrations of LPS or IL-1B for 6 h.Then the expression of cathepsin c mRNA and the secretion of cathepsin c were detected by RT-PcR and ELISA,respectively.The activity of cathepsin c was measured by chromogenic substrate assay.Results After LPS injection,the expression of cathepsin c and cytokines in the brain was up-regulated.At 24 h point,the activated microglia started to express cathepsin c and its expression maintained at the highest level.In contrast,cathepsin c was exclusively expressed in neurons at 6 h point after LPS injection.In vitro,both cathepsin c mRNA expression and cathepsin c protein secretion were increased in LPS or IL-1β-treated BV cells in a dose-dependent manner.In addition,the activity of cathepsin c was also enhanced after treatment.conclusion The results indicate that cytokines induce the expression and activity of cathepsin c in microglia in LPS-induced neuroinflammation,by which catheps

关键词： cathepsin c neuroinflammation cytokine microglia

来源： cnki会议评论

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CathepsinC在小鼠脱髓鞘模型中的表达及其临床意义初步探讨

作者：段卉大连医科大学

学位级别：硕士

目的：研究cathepsin c在cuprizone介导小鼠中枢神经系统（central nervussystem，cNS）脱髓鞘模型中的表达变化，并初步探讨其临床意义。方法：动物实验选取6周龄的雄性c57BL/6小鼠，用0.2％cuprizone分别饲育2周与5周为实验组，建立... 详细信息

目的：研究cathepsin c在cuprizone介导小鼠中枢神经系统（central nervussystem，cNS）脱髓鞘模型中的表达变化，并初步探讨其临床意义。方法：动物实验选取6周龄的雄性c57BL/6小鼠，用0.2％cuprizone分别饲育2周与5周为实验组，建立小鼠中枢神经系统脱髓鞘模型;选取c57BL/6小鼠用正常饲料饲育5周为对照组。通过髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)免疫组化(immunohistochemistry，IHc)和Black Gold髓鞘染色方法，观察髓鞘形态及脱失情况;Iba-1免疫组化检测小鼠胼胝体内小胶质细胞/巨噬细胞系细胞的集聚情况;MPO/Iba-1/GFAP免疫荧光双染检测cathepsin c在小鼠脑组织的表达及细胞定位。临床试验采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测cathepsin c在多发性硬化（multiple sclerosis，MS）患者及非脱髓鞘神经系统疾病患者脑脊液（cerebrospinal fluid，cSF）中表达水平。结果：1.MBP免疫组化及Black Glod髓鞘染色显示：cuprizone饲育小鼠后有脱髓鞘改变，且5周组较2周组严重;对照组未见脱髓鞘改变。2.Iba-1及cathepsin c免疫组化结果显示：实验组胼胝体脱髓鞘部位可见小胶质细胞大量集聚及cathepsin c高表达，5周组较2周组明显;对照组胼胝体部位小胶质细胞少量集聚，cathepsin c不表达。3.MPO/Iba-1/GFAP免疫荧光双染显示:5周组胼胝体部位cathepsin c大部分由小胶质细胞表达，部分由浸润中性粒细胞表达。4.MS患者脑脊液cathepsin c水平高于非脱髓鞘神经系统疾病患者。结论：1.cuprizone喂育小鼠可导致小鼠中枢神经系统脱髓鞘改变。2.cathepsin c高表达引起的小胶质细胞/巨噬细胞系细胞集聚及中性粒细胞浸润可能是髓鞘脱失加重的原因。3.cathepsin c可能参与多发性硬化的发病过程。

关键词： cathepsin c cuprizone 中性粒细胞小胶质细胞多发性硬化

cystatin F在脱髓鞘疾病中的功能意义

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cystatin F在脱髓鞘疾病中的功能意义

作者：李宁大连医科大学

学位级别：硕士

目的:研究Ⅱ型半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin F对中枢神经系统脱髓鞘疾病的影响及其作用机制。方法:利用c57B6/129 cystatin F基因敲除小鼠及其野生型同窝仔通过0.2% cuprizone饲育建立中枢神经系统髓鞘脱失模型,正常c57B6小鼠作为空白... 详细信息

目的:研究Ⅱ型半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin F对中枢神经系统脱髓鞘疾病的影响及其作用机制。方法:利用c57B6/129 cystatin F基因敲除小鼠及其野生型同窝仔通过0.2% cuprizone饲育建立中枢神经系统髓鞘脱失模型,正常c57B6小鼠作为空白对照。采用蛋白脂蛋白(PLP)免疫组化和Black Gold髓鞘染色方法,通过髓鞘残留面积比对基因敲除小鼠胼胝体内髓鞘脱失情况与野生型同窝仔小鼠进行对比研究。通过免疫组化和原位杂交方法分别对cuprizone饲育4周和2周后模型胼胝体内小胶质细胞/巨噬细胞系细胞的集聚及cystatin F抑制的目标酶cathepsin c的表达情况进行分析,借以了解cystatin F影响髓鞘脱失的机制。结果:1.通过髓鞘残留面积比的分析发现cuprizone饲育4周后,基因敲除小鼠和野生型同窝仔的髓鞘残留面积比均显著低于空白对照小鼠;基因敲除小鼠髓鞘脱失情况显著高于野生型同窝仔。2.cuprizone饲育4周后,基因敲除小鼠胼胝体内小胶质细胞/巨噬细胞系细胞数量显著高于野生型同窝仔;同时cathepsin c的表达也显著高于野生型同窝仔。3.cuprizone饲育2周后,基因敲除小鼠和野生型同窝仔的髓鞘残留面积比虽低于空白对照小鼠,但无显著性差异。4.cuprizone饲育2周后,基因敲除小鼠与其野生型同窝仔相比胼胝体内小胶质细胞/巨噬细胞系细胞数量和cathepsin c的表达均无显著性差异。结论:1.cystatin F基因敲除加重cuprizone诱导的髓鞘脱失。2.由cathepsin c高表达所导致的小胶质细胞/巨噬细胞系细胞集聚是cystatin F基因缺乏导致脱髓程度加重的可能原因。3.cystatin F基因敲除不影响少突胶质细胞对cuprizone毒性的敏感性。4.cystatin F基因缺乏并不直接影响cathepsin c表达。

关键词： cystatin F 脱髓鞘 cuprizone cathepsin c 小胶质细胞

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组织蛋白酶c在鼠、人组织中的表达研究

组织蛋白酶C在鼠、人组织中的表达研究

作者：胡鑫第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】组织蛋白酶是广泛存在于多种组织细胞溶酶体内的一类蛋白水解酶,在机体各种生理活动中发挥重要作用。组织蛋白酶种类较多,并具有一定的组织特异性,不同的细胞,甚至是同一种细胞处于不同的生理环境所表达的蛋白酶都不同。根据催... 详细信息

【背景】组织蛋白酶是广泛存在于多种组织细胞溶酶体内的一类蛋白水解酶,在机体各种生理活动中发挥重要作用。组织蛋白酶种类较多,并具有一定的组织特异性,不同的细胞,甚至是同一种细胞处于不同的生理环境所表达的蛋白酶都不同。根据催化中心的不同,组织蛋白酶可分为三类:丝氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶A和G),半胱氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶B、c、L、H、S等),和天冬氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶D和E)。迄今为止,虽然人们已经发现了共10余种组织蛋白酶,但有关其生理功能的了解还远远不够。组织蛋白酶c(cathepsin c,cat c),即为其中的一种。组织蛋白酶c又称二肽基肽酶I(DPPI),该酶发现于十九世纪40年代,是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶,已有的研究表明,该酶在炎症细胞中表达水平较高,可能与颗粒酶的激活有关。除此之外,虽然检测到该酶在多种组织中均广泛表达,但表达情况与功能尚不明确。1999年Toomes等人通过基因检测手段证实,组织蛋白酶c基因(cTSc)突变可引发一种遗传性疾病--掌跖角化综合征(PLS),其典型临床症状为早发型牙周炎并伴有皮肤过度角化,和/或化脓性皮炎,肝、肺脓肿等,从而引发人们对该蛋白酶的关注。该病由法国人Papillon和Lefèvre于1924年首次报告,患病率约为百万分之一到四。迄今为止,不同的研究在PLS患者体内发现多个组织蛋白酶c突变位点,并在多种以早发性牙周炎和/或伴有皮肤过角化为表现的疾病中,如Haim—Munk综合征(HMS)和青春期前牙周炎(PP)中都发现了组织蛋白酶c的基因突变。临床发现,这类疾病的病变主要集中于机体内、外表层器官或组织——牙龈和皮肤,于是我们推测,组织蛋白酶c可能与上皮细胞功能密切相关,该酶的基因突变很可能导致上皮组织的生理功能受到严重影响,从而使牙龈和皮肤局部的防御能力下降,进一步导致疾病的发生。为了证实我们的猜测,在本研究中我们以小鼠多种健康器官的上皮组织、创伤或感染的皮肤,以及人慢性牙周炎牙龈组织、多种口腔黏膜病组织为研究对象,观察了组织蛋白酶c在其中的表达变化,为深入研究组织蛋白酶c的生物学功能提供形态学依据。另外,为了初步探讨组织蛋白酶c的变化与上皮细胞免疫功能变化之间的关系,我们还检测了部分组织中,与上皮细胞免疫密切相关的Toll样受体4的表达变化,以期为进一步深入研究提供参考。【目的】研究健康小鼠多种器官上皮组织中组织蛋白酶c的表达,小鼠皮肤创伤\感染模型中组织蛋白酶c的表达,以及人类牙周病和多种黏膜病组织中组织蛋白酶c和TLR4的表达。【方法】1、小鼠正常生理状态下多种器官上皮组织中组织蛋白酶c的表达研究取c57小鼠肝脏、肺、小肠、膀胱、颊黏膜、牙龈、脚掌皮肤和背部皮肤组织,进行组织蛋白酶c免疫组化染色观察。2、小鼠皮肤创伤/感染状态下组织蛋白酶c的表达变化c57小鼠随机分为3大组(对照组和两个实验组),两实验组分别再随机分为3小组:即健康对照组,12h、24h、48h单纯创伤组,12h、24h、48h创伤合并感染组。单纯创伤组和创伤合并感染组分别在小鼠脚掌皮肤做创伤及创伤合并感染处理,分别于各时间点取材。进行HE染色和组织蛋白酶c免疫组化染色观察。3、人牙周病、多种黏膜病组织中组织蛋白酶c和TLR4的表达研究取人类慢性牙周炎、口腔扁平苔藓、盘状红斑狼疮、白斑和鳞癌组织标本,进行组织蛋白酶c、Toll样受体4(TLR4)免疫组化染色观察。【结果】1、小鼠组织蛋白酶c在肝脏、肺、小肠、膀胱上皮组织中均有较强表达,而颊黏膜、牙龈黏膜、脚掌皮肤及背部皮肤上皮中的表达较弱或不表达。2、HE染色结果显示小鼠皮肤创伤/感染模型建造成功。免疫组化染色结果显示:健康对照组小鼠皮肤组织蛋白酶c表达不明显,而单纯创伤组和创伤合并感染组三个时间点皮肤的上皮和结缔组织中均有组织蛋白酶c染色,染色主要集中在上皮的基底层和棘层细胞,以及结缔组织的炎性细胞中。另外,两个实验组内组织蛋白酶c染色强度随实验时间的增加而呈增强趋势,且创伤合并感染组染色强度略高于单纯创伤组。3、组织蛋白酶c在慢性牙周炎、口腔扁平苔藓、盘状狼疮、白斑和鳞癌组织中均有不同强度的表达,主要表达在上皮的角化层和棘层,以及结缔组织的炎性细胞中;部分标本TLR4表达情况与组织蛋白酶c相似。【结论】1、组织蛋白酶c在小鼠不同器官上皮中的表达各异,推测其在维护上皮细胞正常生理功能方面具有一定的作用。2、组织蛋白酶c在创伤/感染小鼠皮肤结缔组织和上皮中表达上调,提示其与皮肤上皮的创面愈合和炎症反应有密切的关系,可能参与上皮细胞的增殖和分化、及局部免疫防御。3、在处于不同免疫微环境的疾病组织中,组织蛋白酶c的表达主要集中在固有免疫、自身免疫及异常增生情况下的上皮细胞和免疫炎性细胞中,与TLR4的表达有一定相似性,提示组织蛋白酶c可能与上皮细胞免疫功能的发挥有一定关系。

关键词：组织蛋白酶c cathepsin c cTSc DPPI TLR4 免疫

Lacking of cystatin F gene aggravates cuprizone-induced demyelination caused by severe invasion of macrophage lineage cells

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