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Divergent roles of three cytochrome c in CTSb-modulating coelomocyte apoptosis in Apostichopus japonicus

中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会

作者： Wang Yan, Gu Zhen-lun, Liang Zhong-qin, Cao Yi, Han Rong, Qin Zheng-hong Department of Pharmacology, Soochow University Sch, Suzhou 215007

＜正＞Objective: To study the effects of an autophagy/lysosomal pathway in excitotoxicity mediated by Kainic Acid （KA） receptors. Methods: Rat excitotoxic model was produced with stereotaxic administration of kainic acid into unilateral striatum. KA induced formation of autophagosomes was observed with electron microscopy. Protein expression level of cathepsin b was determined with Western blot analysis and immunohistochemistry. The neuroprotective effects of the autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA） and the lysosomal cathepsin b inhibitor Z-FA-FMK were assessed with

关键词： autophagy lysosomal cathepsin b kainic acid excitotoxicity

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Divergent roles of three cytochrome c in CTSB-modulating coe...

溶酶体组织蛋白酶b（cathepsinb）对肺心病兔肺纤维化的作用机理研究

浙江省第四届动物学博士与教授论坛、动物学与经济强省-浙江省动物学研究及发展战略研讨会

作者： Huahui Chen Miao Lv Zhimeng Lv Chenghua Li Weiwei Zhang Xuelin Zhao Xuemei Duan Chunhua Jin Jinbo Xiong Feng Xu Ye Li School of Marine Sciences Ningbo University

Cytochrome c plays crucial roles in apoptosis and the immune *** previously demonstrated that cathepsin b from Apostichopus japonicus(AjCTSb)induces coelomocyte ***,the mechanistic explanation and the regulation of this process have not been *** the present study,we identified three cytochrome c cDNAs from ***(designated Ajcytc1,Ajcytc-1,and Ajcytc-2) using expressed sequence tag-(EST) and RACE-based *** deduced amino acid sequences of the three cytochrome isoforms contained conserved CXXCH motifs,which are involved in binding heme and maintaining proteolytic *** course expression analysis in vitro and in vivo revealed that the three cytochrome isoforms were induced upon pathogen challenge and LPS *** importantly,AjCTSb knockdown by siRNA dramatically increased mitochondrial membrane potential(ΔΨm) in a time-dependent manner based on JC-1 fluorescent probe *** knockdown also resulted in decreased expression of these three cytochromes 24 h after siAjCTSb *** analysis using isoform-specific siRNAs revealed that Ajcytc-1,but not Ajcytcl or Ajcytc-2,is involved in coelomocyte ***,the transcript level of Ajcaspase-3,an apoptosis executioner,was also consistently down-regulated upon silencing of Ajcytc-1 but not Ajcytcl or ***,these results indicate that Ajcytcl,Ajcytc-1,and Ajcytc-2 play distinct roles in mediating the immune response to bacteria according to AjCTSb ***,Ajcytc-1 could be released upon dissipation of the ΔΨm,which could further trigger coelomocyte apoptosis through the activation of Ajcaspase-3.

关键词： Apostichopus japonicus cytochrome c cathepsin b mitochondrial membrane potential apoptosis

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溶酶体组织蛋白酶B（CathepsinB）对肺心病兔肺纤维化的作用机理...

作者：张济周昆明医学院

学位级别：硕士

目的:通过三七总皂苷的抗纤维化作用,研究肺心病兔肺纤维化发病过程中cathepsin b、CbmRNA表达调控,结合病理学观察cathepsin b、CbmRNA在肺纤维化过程中的作用机理,并了解三七总皂苷抗纤维化作用的机制。方法:健康日本大耳兔40只,随机... 详细信息

目的:通过三七总皂苷的抗纤维化作用,研究肺心病兔肺纤维化发病过程中cathepsin b、CbmRNA表达调控,结合病理学观察cathepsin b、CbmRNA在肺纤维化过程中的作用机理,并了解三七总皂苷抗纤维化作用的机制。方法:健康日本大耳兔40只,随机分为5组,每组8只,分别为正常对照组、肺心病模型组、三七总皂苷预防组、治疗组及西药治疗组。观察光镜下5组动物Cb蛋白表达、光镜电镜下肺组织的病理结构变化及CbmRNA表达程度与肺纤维化的关系。结果:正常对照组Cb、CbmRNA的表达很弱,模型组Cb表达呈强阳性,CbmRNA表达明显增高,其它各组也有不同程度的表达;与模型组相比,三七总皂苷预防组能明显降低Cb蛋白、CbmRNA在肺组织中的表达,能明显减轻肺泡水肿,减轻肺间质、肺细小动脉及肺泡壁纤维化,明显减少肺泡水肿液及炎细胞滲出;三七总皂苷治疗组及西药治疗组也有上述作用,但不及三七总皂苷预防组明显。结论:Cb蛋白、CbmRNA在肺纤维化组织中大量表达,Cb呈强阳性,与肺纤维化程度呈正向相关;三七总皂苷能明显改善肺心病兔肺纤维化的程度,能明显降低Cb蛋白、CbmRNA在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞的表达,能减轻致纤维化因素对肺间质、肺部细小动脉及肺泡壁的病理损伤,对肺心病肺脏损伤具有保护作用。

关键词： cathepsin b 肺心病肺纤维化兔作用机理三七总皂苷

Cry41-related蛋白及其突变体与Tma12蛋白的抗蚜作用研究

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Cry41-related蛋白及其突变体与Tma12蛋白的抗蚜作用研究

作者：廖珺奥华侨大学

学位级别：硕士

苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis,简称bt)由于其能产生各种杀虫蛋白,因此作为杀虫制剂被广泛应用。表达bt蛋白的转基因作物也在世界范围内被大规模种植,在防治鳞翅目、鞘翅目农业及种植业害虫上起到了不可忽视的重要作用。但是随... 详细信息

苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis,简称bt)由于其能产生各种杀虫蛋白,因此作为杀虫制剂被广泛应用。表达bt蛋白的转基因作物也在世界范围内被大规模种植,在防治鳞翅目、鞘翅目农业及种植业害虫上起到了不可忽视的重要作用。但是随着bt转基因植物种植面积的不断扩大,一些非靶标昆虫,如半翅目昆虫蚜虫的危害开始日益加重,一跃成为主要害虫。而目前对蚜虫的消灭主要采用化学农药,与如今倡导的可持续农业相违背,因此亟需能够有效控制蚜虫群体数量的环境友好型杀虫蛋白以及筛选有效杀蚜蛋白的方式。首先,利用Cry41-related蛋白及其两种突变体蛋白Cry41-7M及Cry41-6A进行同源建模以及与桃蚜cathepsin b的分子对接,推测三者均可以同cathepsin b产生特异性结合,且不作为cathepsin b的底物。通过分析Cry41-related蛋白及其突变体对cathepsin b活性位点及活性口袋残基的影响,发现Cry41-related蛋白对cathepsin b酶活产生影响的关键因素为对cathepsin b活性口袋构象的影响。根据突变体生测可知,桃蚜若虫对Cry41-7M蛋白具有很高的敏感性,致死中浓度LC50为19.144μg/m L,而Cry41-6A蛋白对桃蚜的致死中浓度LC50为42.478μg/m L。与Palma等人研究得出的Cry41-related致死中浓度相比可知,Cry41-7M蛋白的突变提高了对桃蚜的毒性,而Cry41-6A蛋白的突变降低了对桃蚜的毒性。由此推测,若根据对桃蚜cathepsin b酶活的激活程度筛选抗蚜Cry蛋白,除对cathepsin b具有较高的亲和力外,还需对cathepsin b的活性口袋构象产生正向影响,以提高其酶活,从而增强杀蚜效果。本研究得到了杀蚜效果更好的突变体蛋白Cry41-7M蛋白,并为后续筛选抗蚜Cry蛋白以及提高Cry蛋白的抗蚜性能提供了依据。已知Cry41-related蛋白主要在蚜虫体内发挥其杀虫功效,而甲壳素结合蛋白Tma12可通过体外杀蚜。新型杀虫蛋白Tma12是由蕨类植物大齿叉蕨(Tectaria coadunata)中发现的天然蛋白兼具几丁质酶和多糖单加氧酶活性,对与蚜虫同为同翅目的害虫粉虱具有杀虫活性。因此,原核表达纯化了Tma12,尝试探究该蛋白对桃蚜是否具有杀虫效果,验证其作为新型杀蚜蛋白的功效。采用膜囊法和喷施法两种方法,通过体内体外两个角度验证了Tma12对蚜虫的抗性。通过膜囊法发现,饲喂的Tma12蛋白浓度为30μg/m L时桃蚜的校正死亡率可高达100%。而体外喷施Tma12蛋白的大肠杆菌细胞破碎上清液则导致蚜虫体壁产生明显损伤,使蚜虫处于濒死状态。由此推测,Tma12蛋白的多糖单加氧酶活性是其抗蚜的主要原因。并提出Tma12的抗蚜机理假说:Tma12蛋白在杀蚜过程中先发挥其多糖单加氧酶活性将几丁质分解成小分子,再通过几丁质酶活性将几丁质完全水解。Tma12于体外可以分解蚜虫体表角质层中的几丁质,造成伤口并为昆虫病原体真菌、细菌、病毒等的进入提供窗口加速蚜虫死亡,并可通过孔道进入真皮细胞层直接干扰几丁质的正常合成;于体内可分解肠壁围食膜中的几丁质,对中肠产生破坏,导致蚜虫无法获得正常生命活动所需的营养物质。Tma12能对蚜虫体内体外同时产生破坏,产生巨大的创伤,严重影响其正常生命活动。本研究验证了Cry41-related蛋白及其两种突变体蛋白Cry41-7M及Cry41-6A抗蚜性能,得到了杀蚜效果更好的突变体蛋白Cry41-7M,提出了Cry41-related蛋白提高桃蚜cathepsin b酶活的关键条件,为筛选抗蚜Cry蛋白和提高Cry蛋白抗蚜性能提供了方向;并首次探索了Tma12蛋白对半翅目桃蚜的杀虫活性,证明了Tma12可通过喷施于桃蚜体表达到防治效果,并提出其抗蚜机制假说,为研究活性更高的新型抗蚜蛋白提供了依据。

关键词：苏云金芽胞杆菌 Cry毒素桃蚜 cathepsin b 大齿叉蕨 Tma12 作用机理

GFP-亨廷顿蛋白表达质粒的构建、在哺乳动物细胞中的表达及对溶酶体酶的影响

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GFP-亨廷顿蛋白表达质粒的构建、在哺乳动物细胞中的表达及对溶酶...

作者：陈志欣苏州大学

学位级别：硕士

目的:构建GFP-亨廷顿蛋白表达质粒,观察所构建质粒在哺乳动物细胞中的表达,研究外源性亨廷顿蛋白对细胞溶酶体酶的影响。方法:构建GFP-亨廷顿蛋白表达质粒: pcDNA3-GFP/Htt969-18(代表野生型亨廷顿蛋白N端969个氨基酸,含18个谷氨酰胺)... 详细信息

目的:构建GFP-亨廷顿蛋白表达质粒,观察所构建质粒在哺乳动物细胞中的表达,研究外源性亨廷顿蛋白对细胞溶酶体酶的影响。方法:构建GFP-亨廷顿蛋白表达质粒: pcDNA3-GFP/Htt969-18(代表野生型亨廷顿蛋白N端969个氨基酸,含18个谷氨酰胺)和pcDNA3-GFP/Htt969-100(代表突变型亨廷顿蛋白N端969个氨基酸,含100个谷氨酰胺);采用脂质体转染法转染质粒;应用Western blot、免疫荧光法观察蛋白表达;采用免疫荧光法观察外源性亨廷顿蛋白过表达对细胞溶酶体酶cathepsin b、D的影响。结果:经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应和测序证明质粒构建成功,并且亨廷顿蛋白表达质粒可以在哺乳动物细胞表达;质粒转染后亨廷顿蛋白过表达可显著增加溶酶体酶cathepsin b、D水平。结论:外源性亨廷顿蛋白显著增加溶酶体酶cathepsin b、D水平,提示自噬/溶酶体途径参与了亨廷顿蛋白的加工处理。

关键词：亨廷顿蛋白(Huntingtin, Htt) 聚合酶链式反应 cathepsin b cathepsin D

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新型萘酰亚胺衍生物诱导肿瘤细胞凋亡的研究

新型萘酰亚胺衍生物诱导肿瘤细胞凋亡的研究

作者：邹薇大连理工大学

学位级别：硕士

萘酰亚胺衍生物在治疗肿瘤中的作用显著,已成为了抗肿瘤药物研究的热点之一。其中依利萘法德和双萘法德均已进入了II期临床研究阶段,但是由于其具有较大的毒副作用而未能进入III期临床试验。因此设计开发一类毒副作用更小、抗肿瘤活性... 详细信息

萘酰亚胺衍生物在治疗肿瘤中的作用显著,已成为了抗肿瘤药物研究的热点之一。其中依利萘法德和双萘法德均已进入了II期临床研究阶段,但是由于其具有较大的毒副作用而未能进入III期临床试验。因此设计开发一类毒副作用更小、抗肿瘤活性更强的新型萘酰亚胺衍生物,并寻找和阐明诱导肿瘤细胞凋亡的作用靶点和分子机制,已成为目前研究的重要课题。本研究探讨了不同长度烷基异硫脲阳离子作为连接基的5种新型双萘酰亚胺衍生物DN2-DN6对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用以及作用靶点,并从中筛选出了具有高效抗肿瘤活性的化合物,进一步探讨其对肿瘤细胞的凋亡作用以及分子机制。 MTT法检测了5种新型双萘酰亚胺衍生物DN2-DN6对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果可见,DN2-DN6均能显著抑制MCF-7细胞的生长,降低细胞存活率。5种化合物DN2-DN6的IC50值由小到大的顺序依次为DN6＜DN5＜DN4＜DN3＜DN2,说明化合物对MCF-7细胞的生长抑制作用随烷基异硫脲阳离子连接基长度的增加而增强,烷基链长度与细胞毒性间具有正相关性。其中DN6对细胞的生长抑制作用最强,在作用MCF-7细胞12、24和36h的IC50值分别为11.704±1.84、9.42±2.07和8.04±0.23μmol/L。因此选择DN6探讨其对MCF-7细胞的凋亡作用以及分子机制。采用DAPI荧光染色观察细胞形态、PI单染检测细胞周期分布、AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡率。结果表明DN6以浓度依赖方式诱导MCF-7细胞凋亡,并能干扰DNA的正常合成,造成MCF-7细胞周期阻滞于S期。通过DN2-DN6与中性红（NR）的共定位,观察5种化合物在MCF-7细胞中的作用靶点,吖啶橙（AO）染色观察溶酶体膜稳定性,ELISA法检测组织蛋白酶b （cathepsinb）和细胞色素C的表达量,流式细胞术（FCM）分析bcl-2和bax蛋白表达水平以及线粒体膜电位的变化,分光光度法检测Caspase-9和Caspase-3的表达。结果表明,DN2-DN6均定位于细胞溶酶体中。DN6能以浓度和时间依赖性的方式导致溶酶体膜通透性增加,释放出cathepsin b,作用于bcl-2蛋白,bcl-2/bax蛋白比率降低,进而引起线粒体膜电位下降,细胞色素C的释放,激活Caspase-9和Caspase-3,最终经由溶酶体-线粒体途径引起MCF-7细胞凋亡。

关键词：萘酰亚胺细胞凋亡共定位 cathepsin b 溶酶体-线粒体凋亡途径

自噬溶酶体途径在大鼠脑永久性缺血损伤引起的神经细胞死亡中的作用及机制

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自噬溶酶体途径在大鼠脑永久性缺血损伤引起的神经细胞死亡中的作...

作者：温雅丹苏州大学

学位级别：硕士

目的:观察大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤对自噬-溶酶体的激活,探讨抑制自噬溶酶体途径对大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤的保护作用,以及对抗凋亡蛋白bcl-2的作用。方法:采用线拴法制作大鼠永久性大脑中动脉梗塞(permanent middle cerebra... 详细信息

目的:观察大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤对自噬-溶酶体的激活,探讨抑制自噬溶酶体途径对大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤的保护作用,以及对抗凋亡蛋白bcl-2的作用。方法:采用线拴法制作大鼠永久性大脑中动脉梗塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)模型。用电镜观察大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤对自噬-溶酶体的激活。3-MA (150-600 nmol),cathepsin b inhibitor (CbI) (5-10μg)侧脑室注射给药,以脑梗塞体积、脑水肿、行为学症状等指标评价对缺血性脑损伤的影响。采用western blot法和免疫组化法检测pMCAO大鼠缺血半球皮层中自噬溶酶体相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达。结果:电镜观察显示缺血早期的神经细胞,即可发现自噬小体产生,溶酶体电子密度增加,线粒体和内质网肿胀,在缺血后期,镜下神经细胞表现为凋亡或坏死。3-MA (300和600 nmol)或CbI (7.5和10μg)均可显著改善pMCAO行为障碍,减小脑梗塞体积,减轻脑水肿(Pblot及免疫组化结果显示,脑缺血0h、1h、3h、6h、12h、24h后,大鼠大脑缺血半球皮层内LC3和cathepsin b的表达(Pbeclin 1的表达水平,在1h就迅速升高,达到峰值,3h表达仍然较高(Pbeclin 1和cathepsin b的表达情况,发现给予3-MA (600 nmol)或CbI (10μg)能显著降低LC3、beclin 1和cathepsin b的表达(Pbcl-2的表达,发现表达水平降低(PbI (10μg)后,能使bcl-2的表达恢复至正常水平(PbI对大鼠局灶性缺血性脑损伤有一定的保护作用。4. 3-MA和CbI对大鼠局灶性缺血性脑损伤的保护作用,可能是通过抑制LC3、cathepsin b等的表达,即通过抑制自噬-溶酶体途径来实现的。5. 3-MA和CbI对大鼠局灶性缺血性脑损伤的保护作用,还可能通过提高bcl-2表达,即提高抗凋亡蛋白的表达来完成。

关键词：脑中风自噬溶酶体神经保护凋亡 3-MA cathepsin b inhibitor LC3 cathepsin b bcl-2

肢体缺血预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响

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肢体缺血预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响

作者：冷光朋桂林医学院

学位级别：硕士

目的:急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)是一种复杂的多因素疾病,传统的治疗手段是恢复缺血区的血流灌注,但是这种方法会引起缺血再灌注损伤(IRI)。在这种情况下,需要对新的神经保护措施进行探索。肢体缺血预处理(limb ische... 详细信息

目的:急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)是一种复杂的多因素疾病,传统的治疗手段是恢复缺血区的血流灌注,但是这种方法会引起缺血再灌注损伤(IRI)。在这种情况下,需要对新的神经保护措施进行探索。肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning,LIPC),是指预先对肢体进行反复短暂的缺血再灌注处理,激发机体的内源性保护机制,从而对远隔缺血器官产生保护作用。但是关于LIPC的作用机制至今尚未完全明确,特别是自噬在其中的作用机制。方法:将60只Wistar大鼠按随机原则分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、肢体缺血预处理组(LIPC组)、3-甲基嘌呤组(3-MA组),每组15只。制作脑缺血再灌注、LIPC及3-MA干预大鼠模型,在脑缺血2h再灌注24h后进行神经功能缺陷评分和脑梗死体积测定,HE染色观察细胞形态学改变,Western bloting法检测自噬相关蛋白beclin-1、cathepsin b的表达。结果:1、神经功能缺陷评分:Sham组反应灵敏,无神经功能障碍,与Sham组比较,I/R组,LIPC组,3-MA组均出现程度不同的神经功能障碍(P0.05)。2、脑梗死体积测定:TTC染色后,肉眼观Sham组脑组织呈红色,无脑梗死。与Sham组比较,I/R组,LIPC组,3-MA组均出现程度不同的脑梗死(Pbeclin-1、cathepsin b的表达:与Sham组比较,I/R组beclin-1、cathepsin b的蛋白表达明显增强(Pbeclin-1、cathepsin b的蛋白表达明显减弱(Pbeclin-1、cathepsin b蛋白表达减弱(Pbeclin-1、cathepsin b的过高表达,对IRI大鼠发挥保护作用。(3)自噬抑制剂3-MA能够增强LIPC的脑保护作用。

关键词：脑缺血肢体缺血预处理自噬 beclin-1 cathepsin b

大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬的初步研究

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大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬的初步研究

作者：乜全民苏州大学

学位级别：硕士

目的:研究大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬体、溶酶体的变化,并对其在脑缺血再灌注损伤中的作用进行探讨。方法:采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,透射电镜观察脑缺血再灌注损伤后神经细胞内自噬体形成和溶酶体激活,... 详细信息

目的:研究大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬体、溶酶体的变化,并对其在脑缺血再灌注损伤中的作用进行探讨。方法:采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,透射电镜观察脑缺血再灌注损伤后神经细胞内自噬体形成和溶酶体激活,免疫组织化学法检测损伤周边区(皮层)自噬溶酶体相关蛋白beclin l、cathepsin b的表达。在缺血前应用自噬促进剂雷帕霉素干预自噬途径后,通过神经功能评分、血清神经元特异性烯醇化酶的水平观察促进自噬对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。结果:透射电镜显示,假手术组神经细胞内自噬体、溶酶体数量较少,脑缺血再灌注损伤后2h即可见到损伤周边区神经细胞内自噬体形成、溶酶体增多,12h-24h最为明显,一直持续到5d。免疫组织化学结果显示,假手术组beclin 1、cathepsin b表达较少,脑缺血再灌注损伤后4h beclin l表达增加(Pcathepsin b表达增加(Pbeclin 1、cathepsin b表达水平较低。2.大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤能激活自噬溶酶体途径,表现为缺血半暗带内自噬体的形成和溶酶体的激活,以及beclin 1、cathepsin b随损伤时间表达的变化。3.自噬促进剂雷帕霉素可以减轻脑缺血再灌注损伤,自噬的激活在脑缺血再灌注损伤早期可能参与神经细胞的保护作用。4.通过调节缺血半暗带内神经细胞的自噬溶酶体途径可能是治疗脑缺血再灌注损伤的措施之一。

关键词：自噬脑缺血再灌注损伤 beclin l cathepsin b

大鼠脑缺血再灌注后溶酶体组织蛋白酶b诱导的细胞凋亡及CA-074Me对其的影响

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大鼠脑缺血再灌注后溶酶体组织蛋白酶B诱导的细胞凋亡及CA-074Me...

作者：龚晓燕南华大学

学位级别：硕士

背景与目的细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤后神经细胞死亡的重要方式。凋亡是凋亡相关基因表达的结果,又受许多内外因素的调节。溶酶体中的组织蛋白酶b(cathepsin b、Cb)参与了细胞凋亡的起始环节,在脑缺血再灌注后神经元凋亡中发挥着重要... 详细信息

背景与目的细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤后神经细胞死亡的重要方式。凋亡是凋亡相关基因表达的结果,又受许多内外因素的调节。溶酶体中的组织蛋白酶b(cathepsin b、Cb)参与了细胞凋亡的起始环节,在脑缺血再灌注后神经元凋亡中发挥着重要作用。目前在大鼠脑缺血再灌注模型中有关Cb介导的凋亡通路的研究较少。本研究通过检测局灶性脑缺血再灌注损伤后Cb与线粒体凋亡通路中的重要启动酶Caspase-9之间的表达变化,以探讨Cb在脑缺血再灌注损伤中的作用及其可能的细胞凋亡途径;并且应用Cb抑制剂CA-074Me观察其对上述基因和细胞凋亡的影响及神经保护机制,从而为临床治疗脑缺血提供理论基础和治疗思路。方法将10-12周龄清洁级健康雄性145只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常组(n=10)、假手术(n=15)、脑缺血再灌注模型组(n=60)(模型组)和CA-074Me治疗组(n=60)(干预组)。采用线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血2小时后恢复再灌注,干预组在脑缺血再灌注即刻用CA-074Me(0.4 mg/kg)腹腔注射,其余组于同一时间点腹腔注射等量生理盐水。Longa’s的5级标准评分法评价神经功能缺损。再灌注后分别于1h、6h、24h、48h处死动物。TTC染色测定脑梗死体积的变化;免疫组织化学和RT-PCR法分别检测脑缺血区Cb及Caspase-9蛋白和mRNA表达变化;原位末端标记法检测神经细胞凋亡的变化。结果(1)模型成功率为70.1%,CA-074Me干预能显著减少大鼠神经功能缺损评分(Pb mRNA和蛋白表达;模型组Cb和蛋白表达呈动态变化,于再灌注后1h开始增高,6h达高峰;CA-074Me干预组Cb mRNA和蛋白表达的变化趋势与模型组相似,但数量较其明显减少(Pb表达上调,可能通过线粒体途径参与细胞凋亡。(2)CA-074Me可改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分、减少脑梗死体积,具有良好的抑制神经元凋亡和神经元保护作用。

关键词：脑缺血再灌注凋亡 cathepsin b Caspase-9 CA-074Me