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CRISPR-cas系统预测方法研究与实现

CRISPR-Cas系统预测方法研究与实现

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作者：王金彪扬州大学

学位级别：硕士

规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)及相关蛋白(CRISPR-associated,cas)系统(CRISPR-cas)是一种存在于原核生物(约90%的古细菌和48%的细菌基因)中的一种获得性免疫系统。其免疫过程包括适应、表达和干扰三个阶段,可以特异性地裂解外源入侵的病毒或质粒等。CRISPR-cas系统主要由三部分组成:CRISPR阵列、前导序列和cas基因。CRISPR阵列由重复序列(DirectRepeat,DR)和间隔序列(Spacer)组成。前导序列包含启动子等,可以将CRISPR阵列转录成RNA,参与CRISPR-cas系统的免疫调控。cas基因可以转录翻译成cas蛋白,参与到CRISPR-cas系统整个免疫过程中。同时,CRISPR-cas系统作为一种基因编辑手段已成为新一代基因工程的重要组成部分,在农业、食品、医学等多个领域得到了广泛应用。迄今为止,仍有大量CRISPR-cas系统尚未被发现,这在一定程度上阻碍了对原核生物免疫系统进化的系统性研究。通过传统实验手段去发掘大量CRISPR-cas系统是十分困难的,因此需要先利用生物信息学方法对原核生物全基因组序列进行审查,预测出其中可能的CRISPR-cas系统,再通过实验进一步验证。针对CRISPR-cas系统的两个重要组件(CRISPR阵列和cas基因)的预测问题,本文进行了详细的理论研究与系统实现,主要贡献如下:(1)提出了一种新型的CRISPR阵列预测方法CRISPR-F。该方法通过搜索序列和搜索范围序列的局部双序列比对结果确认目标序列。为了让序列比对更具生物学意义且保持重复序列的高度保守性,在局部双序列比对时只允许有两个碱基位点发生突变。由于允许碱基突变,比对后目标序列左端不相同的碱基理想情况下属于间隔序列。因此去除不相同的碱基并向右端添加相同的碱基,最多达到最大重复序列的长度。在不同序列群多序列比对得到核心序列群后,向两侧以至少75%出现概率添加碱基位,并检查两侧退化的重复序列。最后检查约束条件后得到最终的CRISPR阵列。并通过CRISPR阵列两翼的AT含量预测CRISPR阵列方向。与CRT将全基因序列完全当成字符串相比,CRISPR-F预测得到的重复序列更具生物学意义,充分考虑了重复序列突变中的替换、插入和丢失。(2)提出了一种新型的cas基因预测方法cas-F。该方法是Stacking模型融合的改进方法。首先将蛋白质序列分别从伪氨基酸构成、k-间隔氨基酸对构成和位置特异性得分矩阵三个角度进行特征提取,并分别建立三个SVM模型基学习器。每一个SVM模型都以十折交叉验证进行训练。将这三个SVM模型基学习器的预测结果整合成一个新的特征向量再去训练一个新的SVM模型。将最后的SVM模型作为最终的预测结果,用于判断蛋白质序列是否属于cas蛋白序列。当模型将蛋白质序列判定为cas蛋白序列后,需要通过HMMER程序进行蛋白质图谱的序列相似性搜索确定cas类型。通过实验证明,伪氨基酸构成、k-间隔氨基酸对构成、位置特异性得分矩阵和融合后的SVM模型十折交叉验证的准确率分别为 69.42%、82.43%、80.09%和 83.78%。(3)构建了 CRISPR-cas系统预测及可视化平台CRISPRcasFV。该平台在CrisprVi的基础上,添加了 CRISPR-F和cas-F的功能,并实现了这两个新增模块的可视化。测试结果表明:用户只需要在CRISPRcasFV中上传需要预测的全基因组序列文件(默认FASTA格式文件),CRISPRcasFV可以将CRISPR-F和cas-F预测结果分别详细地展示在各自的可视化界面中。CRISPR-F可视化界面中显示信息包括重复序列和间隔序列的起始位点、终止位点、序列信息、序列长度和方向。cas-F可视化界面中显示信息包括cas类型、方向、起始位点、终止位点、DNA序列和蛋白质序列。综上,本文在系统研究现有CRISPR-cas系统的预测方法基础上,提出并实现了 CRISPR阵列和cas基因的预测方法,并将其整合成为CRISPR-cas系统预测及可视化平台CRISPRcasFV,以推动CRISPR-cas系统领域的相关研究。

关键词： CRISPR-cas系统 CRISPR预测 cas预测可视化

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