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ALKBH5通过m6A修饰调控cysltr2的表达促进胃癌的增殖及机制研究

ALKBH5通过m6A修饰调控CYSLTR2的表达促进胃癌的增殖及机制研究

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作者：付丹丹武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:胃癌(Gastric cancer,GC)的发病率和死亡率一直居高不下,迫切需要对胃癌的发生发展机制进行深入研究以期改善临床现状。N6-甲基腺苷(mA)修饰为基因的表达提供了新层面的调控,mA修饰的整体水平及其调控因子的表达水平的失调对于癌... 详细信息

目的:胃癌(Gastric cancer,GC)的发病率和死亡率一直居高不下,迫切需要对胃癌的发生发展机制进行深入研究以期改善临床现状。N6-甲基腺苷(mA)修饰为基因的表达提供了新层面的调控,mA修饰的整体水平及其调控因子的表达水平的失调对于癌症的发生、进展和转移至关重要。我们前期研究发现去甲基化酶Alk B同源物5(ALKBH5)影响胃癌增殖,ALKBH5介导胃癌增殖的下游靶基因是什么?是否依赖于其去甲基化酶活性?具体的修饰位点及结合蛋白为何?对这些问题进行深入研究可以拓宽对mA修饰参与的胃癌增殖的理解,为胃癌提供潜在的早期筛查指标和治疗药物靶点。方法:利用免疫组织化学(IHC)、实时荧光定量PCR(q PCR)和蛋白质印迹(WB)检测基因在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达水平。利用甲基化RNA免疫沉淀测序(Me RIP-seq)与RNA测序(RNA-seq)来筛选ALKBH5下游靶基因。利用PCR、定点突变技术和同源重组介导的连接构建各个基因的过表达或敲低质粒以及定点突变型质粒。利用短发夹RNA(sh RNA)结合慢病毒筛选稳定转染的胃癌细胞系。利用CCK-8细胞活力测定、Ed U细胞增殖测定及细胞克隆形成检测胃癌细胞的活力和增殖。流式细胞术检测细胞周期。利用裸鼠皮下成瘤实验检测胃癌在裸鼠体内的生长。利用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)、免疫荧光(IF)及荧光原位杂交(FISH)验证ALKBH5和下游靶基因的结合情况和在细胞内的共定位情况。结果:ALKBH5在胃癌中上调,能在体内体外促进胃癌细胞的增殖。cysltr2作为ALKBH5的下游靶标促进了胃癌的增殖。此外,ALKBH5的敲低显著增加了cysltr2 m RNA mA的修饰水平进而下调了cysltr2表达。由ALKBH5去甲基化酶活性突变引起的cysltr2表达下调表明ALKBH5以mA依赖性方式调节cysltr2的表达。同时我们发现ALKBH5介导cysltr2 m RNA的降解依赖于YTHDF2。ALKBH5的过表达去除cysltr2 m RNA上的mA修饰,使得YTHDF2不与该位点的结合,cysltr2 m RNA的稳定性增强从而表达上调,促进胃癌的增殖。结论:本研究表明ALKBH5通过mA修饰调控cysltr2的表达促进胃癌的增殖,其具体机制为,ALKBH5可去除cysltr2 m RNA上的mA修饰,减少cysltr2m RNA与YTHDF2的结合,进而降解减少,表达上调,从而促进胃癌的增殖。这些结果丰富了mA修饰调节在肿瘤恶性增殖中的作用,并为胃癌提供潜在早期筛查生物标志物和治疗靶点。

关键词：胃癌增殖 ALKBH5 cysltr2 YTHDF2

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