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作者：张宇鋆南京农业大学

学位级别：硕士

细胞色素P450是存在于生物体内的一类氧化酶,它作为重要的解毒酶参与了昆虫的化学防御,在植食性昆虫与寄主植物的协同进化过程中发挥着关键的作用。与大多数P450基因成簇存在且解毒功能多样化的特点不同,鳞翅目昆虫特有的cyp6ab亚家族P... 详细信息

细胞色素P450是存在于生物体内的一类氧化酶,它作为重要的解毒酶参与了昆虫的化学防御,在植食性昆虫与寄主植物的协同进化过程中发挥着关键的作用。与大多数P450基因成簇存在且解毒功能多样化的特点不同,鳞翅目昆虫特有的cyp6ab亚家族P450底物谱可能较窄,基因也不成簇分布。为了明确cyp6ab亚家族特殊的的进化模式及其解毒代谢功能,本研究利用基因组数据分析了39个鳞翅目昆虫中的cyp6ab基因,通过系统发育分析明确了该亚家族同源基因之间的进化关系,利用离体表达方法鉴定了该亚家族蛋白对模式底物、欧前胡素、花椒毒素和顺式氰戊菊酯的代谢活性,通过实时定量PCR技术测定了棉铃虫cyp6ab亚家族及其近缘亚家族P450基因对欧前胡素等多种外源化合物的诱导响应。本研究结果丰富了昆虫P450家族的基因进化与功能关系的相关理论,同时为解析昆虫P450介导的寄主植物适应性和化学防御提供了新的证据和视角。具体结果如下:1.鳞翅目cyp6ab亚家族P450基因的系统发育分析依据已经发表的昆虫P450基因序列,从39个鳞翅目双孔亚目昆虫基因组中鉴定出了334个cyp6ab基因,其中271个具有完整的开放阅读框。由于内含子的插入,该亚家族出现基因结构变异现象,共有四种基因结构类型,即1外显子、2外显子、3外显子和4外显子类型。除了菜粉蝶、烟草天蛾和六星灯蛾,cyp6ab亚家族在其余36个物种中都发生了两次及以上基因复制事件,在螟蛾科、卷蛾科、谷蛾科、凤蝶科、蚬蝶科等12个物种中基因数量都超过10个。通过系统发育分析发现,多数3外显子类型的cyp6ab进化关系紧密,同时,除了少数近期复制的旁系同源基因,大多数直系同源基因的进化关系更近。结果表明cyp6ab亚家族的P450基因进化活跃,且分化时间较早,在多数物种形成前已完成分化。2.鳞翅目昆虫cyp6ab亚家族P450基因的离体功能验证及功能分化选择31个具有代表性的cyp6ab亚家族P450进行离体功能研究,检测其对六种荧光模式底物、两种呋喃香豆素(欧前胡素和花椒毒素)以及顺式氰戊菊酯的代谢能力。8个P450s对6种模式底物都不具有代谢活性,19个P450s只代谢1-2种荧光模式底物,仅二化螟cyp6ab53和柑橘凤蝶cyp6ab-1788可以代谢5种模式底物。31个重组cyp6ab P450s中仅有二化螟cyp6ab53和柑橘凤蝶cyp6ab-1788可以代谢花椒毒素,且代谢速率较低(分别是0.15和0.042 pmol/min/pmol P450)。仅有9个P450s可以代谢杀虫剂顺式氰戊菊酯,代谢速率最高的是红带袖蝶cyp6ab-1g1(0.119 pmol/min/pmol P450)。然而,其中有15个P450s可以代谢欧前胡素,在系统进化上也多属于3外显子类型的进化枝,二化螟cyp6ab53对欧前胡素的代谢最快,代谢速率达到1.06 pmol/min/pmol P450,并且欧前胡素可以广泛被cyp6AE、cyp321A、cyp6B、cyp9A和cyp337B亚家族P450代谢。结果表明cyp6ab是一个底物谱较狭窄的P450亚家族,并且cyp6ab亚家族对欧前胡素的代谢功能是典型的亚功能化,主要继承于特定的进化分枝中,且部分同源基因在后续的进化中丧失了该功能。3.棉铃虫cyp6ab亚家族P450基因对外源化合物的转录响应通过定量PCR技术测定了棉铃虫cyp6ab亚家族P450基因对花椒毒素、2-十三烷酮、顺式氰戊菊酯和欧前胡素的转录响应。经1 mg/g花椒毒素处理48h后,棉铃虫中肠中仅有cyp6ab20表达量显著上调2.5倍,脂肪体中仅cyp6ab9(1.4倍)和cyp6ab10(1.8倍)基因表达量出现上调。在1 mg/g 2-十三烷酮处理后,仅中肠中cyp6ab9和cyp6ab38的表达量发生了上调,上调倍数为1.6倍。经5μg/g顺式氰戊菊酯诱导后,仅中肠中的cyp6ab10(2.1倍)基因表达量发生了上调。使用1 mg/g欧前胡素处理48 h,发现棉铃虫cyp6ab亚家族P450基因没有出现诱导性的高表达,但中肠中的cyp6AE19(354倍)、cyp6AE20(267倍)以及cyp321A2(58倍)的表达量发生了显著升高,脂肪体中cyp9A12(5.6倍)、cyp6AE11(8.5倍)、cyp6AE15(36.9倍)、cyp6AE19(22.1倍)、cyp321A1(3.2倍)、cyp321A2(12.7倍)、cyp321A5(4.9倍)和cyp6AW1(12.3倍)共8个P450s的表达量也显著上调。结果表明棉铃虫cyp6ab亚家族P450基因对上述化合物的诱导响应较弱,P450的可诱导性和代谢功能之间没有绝对的相关性。

关键词：鳞翅目 cyp6ab 系统进化解毒代谢转录响应

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甘蓝夜蛾细胞色素P450cyp4M及cyp6ab基因的克隆与表达研究

甘蓝夜蛾细胞色素P450CYP4M及CYP6AB基因的克隆与表达研究

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作者：高艳玲东北农业大学

学位级别：硕士

细胞色素P450(cytochrome P450或cyp450,简称P450)是一种广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内的氧化酶系,由数量众多、功能复杂的一类血红蛋白酶组成。在昆虫中,P450分布在昆虫的各个组织器官中,参与昆虫生长、发育、繁殖等重要的生... 详细信息

细胞色素P450(cytochrome P450或cyp450,简称P450)是一种广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内的氧化酶系,由数量众多、功能复杂的一类血红蛋白酶组成。在昆虫中,P450分布在昆虫的各个组织器官中,参与昆虫生长、发育、繁殖等重要的生理活动,例如昆虫体内蜕皮激素与保幼激素等内源化合物的合成降解。它们对异生物质的代谢作用导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物毒素的耐受性。P450酶通过NADPH获得电子起末端氧化的作用,由P450催化的反应不仅包括氧原子的转移,同时P450酶还具有氧化酶、还原酶、异构酶及脱氢酶的活性。分离昆虫P450基因并研究其特征是明确P450如何参与虫体内重要的代谢过程的第一步,研究在很大程度上发现了昆虫抗药性形成的机理,以及使用杀虫剂对昆虫生物学和生理学的影响。本研究针对昆虫P450基因在昆虫体内不同时期不同组织的存在着差异性,确定了在其活性较高的五龄幼虫期提取mRNA,进一步通过***等技术克隆了甘蓝夜蛾P450cyp4M以及cyp6ab基因全长序列。 cyp4McDNA序列含有1909个碱基,包括一个1572个碱基的开放阅读框,编码一个含523个氨基酸的多肽,分子量约为60.9kDa,等电点为8.65。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号JF731346。利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility对推导的甘蓝夜蛾cyp4M氨基酸的结构域进行预测,蛋白序列中含有P450酶的特征结构FxxGxxxCxG(461-470)血红蛋白结合域,与其它昆虫cyp4M基因有较高的同源性。将得到的cyp4M基因利用表达载体pET21b转入受体BL21中进行原核表达,经异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别获得与预测蛋白大小相同的蛋白条带。 cyp6ab cDNA序列含有1966个碱基,包括一个1539个碱基的开放阅读框,编码一个含512个氨基酸的多肽,分子量约为58.8kDa,等电点为8.43。获得的甘蓝夜蛾cyp6ab基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号JQ901385。使用生物学软件分析甘蓝夜蛾的cDNA序列的分子特性,蛋白序列中同样含有P450酶的特征结构FxxGxxxCxG (446-455)血红蛋白结合域。构建原核表达载体,完成甘蓝夜蛾cyp6ab基因在大肠杆菌表达系统中的表达。

关键词：甘蓝夜蛾 P450 cyp4M cyp6ab 克隆表达

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小地老虎P450cyp6ab基因的克隆与序列分析

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东北农业大学学报 2013年第7期44卷 137-142页

作者：樊东高艳玲邱广伟赵奎军周夏东北农业大学农学院哈尔滨150030

细胞色素P450(Cytochrome P450或cyp450,P450)是一类广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内的亚铁血红素硫醇盐蛋白,该家族数量众多、功能复杂。在昆虫中,P450分布在昆虫的各个组织器官中,参与昆虫生长、发育、繁殖等重要生理活动,同时... 详细信息

细胞色素P450(Cytochrome P450或cyp450,P450)是一类广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内的亚铁血红素硫醇盐蛋白,该家族数量众多、功能复杂。在昆虫中,P450分布在昆虫的各个组织器官中,参与昆虫生长、发育、繁殖等重要生理活动,同时参与昆虫对植物毒素的适应性以及对常用化学杀虫剂的代谢。研究以小地老虎(Agrotis ipsilon Hufngel)5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到小地老虎cyp6ab基因cDNA序列。该序列含有2 260个碱基,包括一个1 536个碱基的开放读码框,编码512个氨基酸,分子质量约为59.13 ku,多肽等电点为7.92。使用生物学软件分析发现,小地老虎cyp6ab蛋白序列中含有P450酶的特征结构FxxGxxxCxG(446-455)血红蛋白结合域。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫cyp6ab高度同源。获得的小地老虎cyp6ab基因cDNA序列已登录GenBank并获得登录号,登录号为JQ901386。

关键词：小地老虎 cyp6ab 克隆序列分析

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