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cxcr4启动子驱动的双荧光报告基因载体构建与活性观察

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CXCR4启动子驱动的双荧光报告基因载体构建与活性观察

作者：王瑜沈阳农业大学

学位级别：硕士

趋化因子(chemokines)及其相应趋化因子受体(chemokine receptors)不仅参与了胚胎发育、淋巴细胞的转运、血管生成等生物体内的各种重要的生命活动,并且在免疫性疾病及各种肿瘤中发挥着关键的不可或缺的作用。大量临床研究表明,乳腺癌... 详细信息

趋化因子(chemokines)及其相应趋化因子受体(chemokine receptors)不仅参与了胚胎发育、淋巴细胞的转运、血管生成等生物体内的各种重要的生命活动,并且在免疫性疾病及各种肿瘤中发挥着关键的不可或缺的作用。大量临床研究表明,乳腺癌患者的乳腺组织与健康人正常乳腺组织相比,cxcr4的表达量明显要高,不仅如此,还发现它的相应配体CXCL12在肝、肺、淋巴结、骨髓等这些癌细胞常转移去的靶器官组织中也均高表达,表明癌细胞表达的趋化因子及其转移的靶器官表达的相应趋化因子受体与靶器官特异转移密切相关。然而,目前关于cxcr4的研究特别是基因表达的研究大部分集中在cxcr4日性细胞和阴性细胞的混合细胞,不能完全了解cxcr4单阳性细胞的基因表达情况。因此,本项研究的目的是拟建立一种用来分离cxcr4单阳性细胞的方法,以方便对其基因表达及体内转移行为的研究。本项研究的方法是通过构建一种双荧光蛋白报告基因载体,并以cxcr4基因启动子驱动绿色荧光蛋白,以小鼠组成性启动子驱动参比报告基因红色荧光蛋白,并以此双荧光蛋白报告基因转染小鼠乳腺癌细胞,经荧光检测验证报告基因活性之后,采用流式细胞仪技术分选cxcr4阳性细胞,进而进行体外培养观察cxcr4阳性和阴性细胞的体外生长特性,为进一步开展cxcr4阳性和阴性细胞的体内转移的研究奠定基础。研究结果表明,双荧光蛋白报告基因载体构建成功,体外活性检测表示所构建的双荧光报告基因载体具有活性。以cxcr4特异性启动子驱动的双荧光蛋白也具有活性。以双荧光蛋白报告基因转染的细胞经流式细胞仪分选后获得了cxcr4阳性细胞和阴性细胞,并且经体外细胞培养观察发现,cxcr4 P日性细胞具有细胞延展性弱、细胞伪足较短,贴壁不牢固等生长特性,cxcr4阴性细胞具有细胞延展性强,细胞伪足较长,贴壁牢固的生长特性。体外培养充分证实cxcr4阳性细胞与cxcr4阴性细胞具有明显的生长模式,这为进一步进行体内研究提供了可靠的依据。本项研究结果的意义还在于,利用基因启动子筛选基因表达阴性和阳性的细胞,相比于用特异性抗体筛选的方法,更有利于保持癌细胞原始性和完整性,有利于体外培养生长,并对移植和肿瘤重建不产生影响;本研究构建的双荧光报告基因载体还可用于其他动物基因启动子的替换,分选不同基因表达的阳性细胞,是一种快捷方便的报告基因载体。并且本研究中克隆的两段cxcr4启动子在乳腺癌细胞中均具有足够启动外源基因表达的活性,所以可以利用cxcr4启动子特异性的在癌细胞中启动治疗基因的表达来实现肿瘤基因治疗的靶向性。并且cxcr4上游500bp大小的启动子具有足够的活性并且序列较短,所以能够增加载体携带外源基因的容量。

关键词： cxcr4启动子乳腺癌细胞双荧光报告基因载体

复方大青叶注射液对体外培养HT-H9细胞cxcr4启动子活性的影响

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郑州大学学报（医学版） 2011年第5期46卷 681-684页

作者：冷弘刘慧涛臧玉翠马云云李敏靳静赵国强洛阳职业技术学院免疫学与病原生物学教研室洛阳471000 南阳油田总医院消化肾病科南阳473132 郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450001 河南省职工医学院微生物学与免疫学教研室郑州451191

目的:探讨复方大青叶注射液对体外培养HT-H9细胞中cxcr4启动子活性的作用。方法:克隆人CX-CR4启动子序列,构建报告载体pGL4.17-cxcr4;转染HT-H9细胞株,G418筛选后分组,高、低剂量实验组分别用200、100mg/L大青液注射液处理,设注射水对... 详细信息

目的:探讨复方大青叶注射液对体外培养HT-H9细胞中cxcr4启动子活性的作用。方法:克隆人CX-CR4启动子序列,构建报告载体pGL4.17-cxcr4;转染HT-H9细胞株,G418筛选后分组,高、低剂量实验组分别用200、100mg/L大青液注射液处理,设注射水对照组、空白对照组和未转染对照组;各组处理24h后,进行荧光素酶活性检测。结果:成功构建含人cxcr4启动子序列的报告载体PGL4.17-cxcr4;5组荧光素酶活性比较差异有统计学意义(F=135.510,Pcxcr4启动子活性。

关键词：复方大青叶注射液 cxcr4启动子艾滋病 HT-H9细胞

初步建立作用于人cxcr4启动子药物的筛选方法

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初步建立作用于人CXCR4启动子药物的筛选方法

作者：马云云郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的。HIV进入CD4细胞是通过病毒的衣壳糖蛋白、CD4受体与趋化因子受体之间相互作用而完成的... 详细信息

背景和目的获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的。HIV进入CD4细胞是通过病毒的衣壳糖蛋白、CD4受体与趋化因子受体之间相互作用而完成的。CD4分子是HIV-1感染宿主细胞的主要受体,可是,在HIV病毒感染的过程中,都需要有辅助受体与CD4协同作用。cxcr4(CXC-chemokine receptor4,cxcr4)作为第一个被发现的辅助受体,主要分布在机体的免疫细胞表面,属七次跨膜的G蛋白偶联膜受体,与cxcr1-cxcr6、CCR1-CCR11、XCR1和XCR2等同属于趋化因子受体家族。HIV病毒在感染宿主细胞过程中,病毒表面的糖蛋白gp120先与细胞表面CD4受体结合,吸附于宿主细胞上,然后gp120再与辅助受体(cxcr4或CCR5)相互作用,病毒进一步接近宿主细胞,病毒表面跨膜蛋白gp41构象发生变化,导致病毒包膜与宿主胞膜融合,病毒的RNA进入细胞。近年来,针对于病毒吸附与穿入环节的抗HIV药物成为研究的热点。中药作是我国独特的药物资源宝库,种类繁多,作用各异,其中是否存在能影响cxcr4启动子的活性、降低cxcr4的表达,从而起到预防、治疗AIDS的药物,是值得进一步研究的问题。为此,本实验拟建立一种方法,筛选作用于cxcr4启动子的具有潜在抗HIV/AIDS作用的中药。我们先将cxcr4启动子片段克隆到pGL4载体上,再将构建好的带有cxcr4启动子的萤光素酶报告基因转染入急性淋巴瘤细胞(Jurkat细胞),利用载体上的筛选标记neo基因,用G418筛选得到稳定转染克隆。然后选取13种中药分别给大鼠连续灌胃七天后采血,分离出含药血清刺激转染细胞株,通过检测报告基因萤光素酶的活性,判断这些中药对cxcr4启动子转录作用的影响,建立作用于HIV辅助受体cxcr4启动子的抗HIV/AIDS药物体外筛选方法。方法设计并合成扩增cxcr4启动子的引物,从含有cxcr4启动子序列的pUC-cxcr4质粒中PCR扩增cxcr4的启动子基因序列;将cxcr4启动子基因片段克隆入T载体(pGEM-T-cxcr4),再亚克隆进pGL4萤光素酶报告载体,PCR、双酶切筛选阳性重组子,并进行DNA序列测定,得到pGL4-cxcr4;脂质体包裹转染pGL4-cxcr4入Jurkat细胞(急性T淋巴细胞白血病细胞),G418筛选得到稳定转染细胞株,扩大培养后分组;使用13种中药煎剂(黄芩、黄连、黄柏、金银花、连翘、半边莲、鱼腥草、大青叶、板蓝根、灵芝、穿心莲、猪苓、甘草),分别给成年Wistar大鼠连续灌胃7天后采血,分离含药血清;将13种含药血清分别作用于各组稳定转染细胞后,通过检测报告基因萤光素酶活性反映各含药血清对cxcr4启动子的作用。结果数据用统计学软件SPSS13.0分析。结果 ***扩增cxcr4启动子基因片段,电泳可见777bp处有明亮条带,与设计一致。 2.将cxcr4启动子基因片段与pGEM-T Easy连接后,转化DH5α,筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-cxcr4。 3.将cxcr4启动子基因片段亚克隆入萤光素酶报告基因载体pGL4,得到萤光素酶报告质粒pGL4-cxcr4。PCR扩增及双酶切鉴定证明插入序列正确,DNA序列测序,结果与设计完全一致。 4.G418筛选得到稳定转染pGL4-cxcr4细胞株。 5.萤光素酶活性检测:黄柏组细胞的萤光素酶萤光值为406175.2±35146.2,鱼腥草组为612186.8±38890.9,与对照组萤光值869159.0±62618.8相比,显著降低(P＜0.05);半边莲组细胞的萤光素酶萤光值为1146839±106138.3,较对照组显著升高(P＜0.05)。结论 1.构建cxcr4启动子的萤光素酶报告基因载体,应用血清药理学方法,建立起作用于cxcr4启动子药物的体外筛选方法。 2.黄柏和鱼腥草可降低体外培养细胞中cxcr4启动子的活性,可能具有潜在的抗HIV/AIDS作用,值得进一步的实验证实。

关键词： cxcr4启动子药物筛选抗艾滋病药物报告基因

穿心莲对人外周血CD4^+T淋巴细胞表面cxcr4和CCR5的影响以及对cxcr4/CCR5启动子作用机制的研究

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中国中药杂志 2011年第21期36卷 3012-3017页

作者：冯龙赵国强马云云李敏马晶靳静崔英河南中医学院基础医学院河南郑州450008 郑州大学基础医学院河南郑州450001 河南省职工医学院河南郑州451191 河南中医学院药学院河南郑州450008

目的:探讨穿心莲对人外周血CD4+T淋巴细胞表面趋化因子受体cxcr4和CCR5的影响以及对cxcr4,CCR5启动子的作用机制。方法:健康志愿者口服含穿心莲内酯的穿心莲胶囊后,采集人外周静脉血并分离CD4+T淋巴细胞,RT-PCR、流式细胞术、Western-bl... 详细信息

目的:探讨穿心莲对人外周血CD4+T淋巴细胞表面趋化因子受体cxcr4和CCR5的影响以及对cxcr4,CCR5启动子的作用机制。方法:健康志愿者口服含穿心莲内酯的穿心莲胶囊后,采集人外周静脉血并分离CD4+T淋巴细胞,RT-PCR、流式细胞术、Western-bloting检测服药前后人外周血CD4+T淋巴细胞表面cxcr4,CCR5的表达;采用报告基因技术,中药穿心莲提取物给大鼠灌胃后采集含药血清,将含药血清作用于转染有cxcr4,CCR5启动子载体的H9细胞株,检测穿心莲对cxcr4,CCR5启动子的影响。结果:健康志愿者口服穿心莲后,外周血CD4+T淋巴细胞表面cxcr4,CCR5 mRNA和蛋白表达水平较服药前显著降低;并且穿心莲能够显著降低体外培养细胞cxcr4,CCR5启动子活性。结论:穿心莲能够降低人外周血CD4+T淋巴细胞表面cxcr4和CCR5的表达,具有潜在的抗HIV-1作用。

关键词：穿心莲 cxcr4启动子 CCR5启动子中药抗艾滋病药物

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cxcr_4启动子报告载体的构建

肿瘤基础与临床 2015年第4期28卷 281-283页

作者：王艳李丹黄可殷小成惠州市第一妇幼保健院儿科广东惠州516001 南华大学附属第一医院儿科湖南衡阳421001

目的构建并鉴定含人cxcr4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人cxcr4基因启动子的序列,构建报告载体Pg L4.17-cxcr4,以其转染Jurkat细胞,然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的cxcr4启动子序列与克隆人Pg L4.17-cxcr4的CX... 详细信息

目的构建并鉴定含人cxcr4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人cxcr4基因启动子的序列,构建报告载体Pg L4.17-cxcr4,以其转染Jurkat细胞,然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的cxcr4启动子序列与克隆人Pg L4.17-cxcr4的cxcr4启动子序列和Gen Bank报道的一致。实验组荧光素酶的表达活性是874 809.020 0±39 510.624 6,与空白组的465.900 0±26.250 1和对照组的37 981.980 0±2 384.341 2总体比较差异有统计学意义(F=4 678.919,Pcxcr4基因启动子的荧光素酶的Pg L4.17-cxcr4报告载体被成功构建。

关键词： cxcr4启动子荧光素酶报告载体 Jurkat细胞

大蒜素对Jurkat细胞cxcr4表达的影响

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现代肿瘤医学 2016年第2期24卷 181-183页

作者：王艳李丹黄可殷小成惠州市第一妇幼保健院儿科广东惠州516001 南华大学附属第一医院儿科湖南衡阳421001

目的:探讨大蒜素对体外培养的Jurkat细胞中cxcr4启动子活性的影响。方法:克隆人cxcr4启动子序列,构建报告载体Pg L4.17-cxcr4,转染Jurkat细胞,G418筛选分组后,大蒜处理分高、中、低浓度3组(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml),以未做任何处... 详细信息

目的:探讨大蒜素对体外培养的Jurkat细胞中cxcr4启动子活性的影响。方法:克隆人cxcr4启动子序列,构建报告载体Pg L4.17-cxcr4,转染Jurkat细胞,G418筛选分组后,大蒜处理分高、中、低浓度3组(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml),以未做任何处理的转染细胞作为对照组,以注射用水处理的转染细胞作为注射水对照组,各组处理24h后,在相应的条件下进行荧光素酶活性测定。结果:成功构建了含人cxcr4启动子序列的Pg L4.17-cxcr4报告载体,6组荧光素酶活性比较,差异有统计学意义(Pcxcr4启动子的表达,有效抑制体外培养的Jurkat细胞中的cxcr4启动子活性。

关键词：大蒜素 Jurkat细胞 cxcr4启动子