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β-连环样蛋白1抑制HIV-2整合作用及机制研究

β-连环样蛋白1抑制HIV-2整合作用及机制研究

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作者：白汀杨中国医科大学

学位级别：硕士

目的:艾滋病,是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染引起的一种严重疾病,病毒的潜伏感染是目前艾滋病治愈面临的最主要难题之一。根据HIV的遗传差异可分为HIV-1型和HIV-2型。HIV-2的毒力和传播能力较低,消耗免... 详细信息

目的:艾滋病,是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染引起的一种严重疾病,病毒的潜伏感染是目前艾滋病治愈面临的最主要难题之一。根据HIV的遗传差异可分为HIV-1型和HIV-2型。HIV-2的毒力和传播能力较低,消耗免疫系统的速度更慢,较HIV-1更容易诱导机体产生中和抗体。近年来HIV-2感染者数量不断增加,人类宿主蛋白对抗HIV-2感染能力的潜在机制尚未完全解析。随着人们对HIV病毒的深入研究,这种病毒与人体间相互作用机制逐渐清晰,多种存在于宿主细胞的蛋白被发现参与了HIV病毒的抗感染过程。β-连环样蛋白1（β-catenin-like 1,ctnnbl1）是一种对抗HIV-1整合过程的新型宿主细胞限制因子。因此探讨ctnnbl1在HIV-2感染中的作用及分子机制,为寻找新的HIV-2感染的临床治疗靶点提供实验依据。研究方法:1.采用RT-q PCR和Western Blot检测HIV-2Luc（VSV-G）感染是否影响细胞中ctnnbl1的m RNA和蛋白水平。2.采用si-ctnnbl1或sh-ctnnbl1及ctnnbl1过表达质粒分别在293T细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、原代激活CD4T细胞和静息CD4T细胞中敲减内源性ctnnbl1或过表达外源性ctnnbl1,感染HIV-2 Luc（VSV-G）后分别通过（1）荧光素酶活性检测,探究内外源表达的ctnnbl1对HIV-2病毒复制的作用;（2）提取细胞基因组DNA和环状病毒DNA,采用q PCR和巢式PCR（Nested PCR）分别检测HIV-2的晚期逆转录产物（Late RT,代表总c DNA分子）、未整合产物2-LTR（环状病毒DNA分子）、整合病毒DNA分子（Integrants）,检测ctnnbl1对HIV-2病毒整合的作用。3.在293T细胞中将ctnnbl1表达质粒或对照质粒分别与野生型HIV-2前病毒质粒共同转染,收集细胞上清液感染TZM-bl报告细胞以检测ctnnbl1对HIV-2侵染能力的影响。4.通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）在HIV-2侵染细胞系系统中检测ctnnbl1和HIV-2整合酶(HIV-2 Integrase,IN)是否存在相互作用;在ctnnbl1过表达系统中检测ctnnbl1和LEDGF/p75是否存在相互作用;在HIV-2侵染原代细胞系统中检测ctnnbl1、LEDGF/p75和IN三者之间是否存在相互作用。5.通过大肠杆菌分别纯化重组蛋白ctnnbl1、IN、LEDGF/p75,进行GST pull-down实验,验证ctnnbl1、IN、LEDGF/p75之间的相互作用。通过体外模拟链转移实验检测ctnnbl1、IN、LEDGF/p75相互作用对HIV-2整合过程的影响。结果:***-2Luc（VSV-G）感染不影响细胞中ctnnbl1的转录和翻译的水平。2.在293T细胞中过表达ctnnbl1后感染HIV-2Luc（VSV-G）,荧光素酶活性呈现下降趋势,说明ctnnbl1抑制HIV-2病毒复制,且随着ctnnbl1表达量的增加,抑制作用显著增加。相反,在293T细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、原代激活CD4T细胞和静息CD4T细胞中敲低ctnnbl1的表达,荧光素酶活性呈现上升趋势,说明敲低ctnnbl1促进HIV-2病毒复制。3.过表达或敲低ctnnbl1的表达不影响HIV-2的Late RT水平,说明ctnnbl1不影响HIV-2的逆转录。而过表达ctnnbl1后,Integrants水平显著降低,2-LTR水平显著升高;敲低ctnnbl1的表达后,Integrants水平显著升高,2-LTR水平显著降低。以上结果说明ctnnbl1抑制HIV-2病毒DNA整合到宿主基因组中。***1不抑制HIV-2子代病毒的产生和子代病毒的侵染能力。***1与IN和LEDGF/p75存在相互作用。ctnnbl1通过与LEDGF/p75相互作用抑制病毒IN的体外链转移活性。结论:***1通过抑制HIV-2病毒DNA整合到宿主基因组,进而发挥抗病毒作用。***1通过与LEDGF/p75结合而识别IN,进而抑制IN的链转移活性。

关键词： HIV-2 ctnnbl1 LEDGF/p75 整合酶

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