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腺病毒介导ctla4ig基因修饰骨髓间充质干细胞降低大鼠移植物抗宿主病的研究

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中华血液学杂志 2004年第8期25卷 506-508页

作者：郭小荑邓宇斌原清涛梁海翔中山大学病理生理学教研室广州510080 广州市第二人民医院矫形外科

移植物抗宿主病(GVHD)是异基因造血干细胞移植后最主要的并发症,解决GVHD的关键在于干预T细胞活化的起始阶段,诱导T细胞对受体的特异性无反应.ctla4ig作为阻断T细胞B7/CD28共刺激通路的最有效制剂,其诱导特异性免疫耐受的作用受到广泛关... 详细信息

移植物抗宿主病(GVHD)是异基因造血干细胞移植后最主要的并发症,解决GVHD的关键在于干预T细胞活化的起始阶段,诱导T细胞对受体的特异性无反应.ctla4ig作为阻断T细胞B7/CD28共刺激通路的最有效制剂,其诱导特异性免疫耐受的作用受到广泛关注.我们拟用前期构建的重组腺病毒表达载体Ad-ctla4ig体外修饰大鼠骨髓间充质干细胞(MSC),通过MSC介导的基因治疗研究目的基因CTIA4ig在大鼠异基因骨髓移植模型中对GVHD的抑制作用,同时探讨转基因MSC在体内的定向迁移特性,为骨髓MSC在基因治疗中的应用提供新的实验依据。

关键词：腺病毒 ctla4ig基因骨髓间充质干细胞大鼠移植物抗宿主病 GVHD 免疫组化

移植物局部转染ctla4ig基因对大鼠小肠移植排斥反应的预防作用

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中华器官移植杂志 2005年第1期26卷 33-35页

作者：王一芳赖福生许爱刚吴文溪南京医科大学第一附属医院胃肠外科 210029

目的探讨ctla4ig基因在移植小肠局部转染表达及表达产物对排斥反应的预防作用。方法大鼠小肠移植前,经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的ctla4igcDNA重组质粒,术后应用组织免疫学及逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测移植小肠中ctla4ig转... 详细信息

目的探讨ctla4ig基因在移植小肠局部转染表达及表达产物对排斥反应的预防作用。方法大鼠小肠移植前,经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的ctla4igcDNA重组质粒,术后应用组织免疫学及逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测移植小肠中ctla4ig转基因产物的表达,并行组织病理学检查,同时设立无ctla4ig基因转染的对照组。结果对照组(n=8)的移植小肠在术后7～14d全部坏死;实验组(n=18)7只受鼠的移植小肠于术后56～90d坏死,11只受鼠的移植小肠于术后90d时仍存活良好。对照组移植物组织切片见单核细胞广泛浸润,肠壁肌层及黏膜出血坏死,绒毛及隐窝结构消失;实验组存活超过90d者组织切片仅见少量单核细胞浸润,黏膜轻度增厚,但无明显的肠绒毛缩短及隐窝细胞减少等改变。组织免疫学及RTPCR结果显示,在移植后28d内移植小肠中有ctla4ig转基因产物的表达,但第56d及90d则检测不到其表达。结论经肠系膜上动脉体外灌注脂质体包裹的ctla4igcDNA重组质粒可有效转染移植小肠,ctla4ig基因在移植小肠局部转染对术后的排斥反应具有预防作用。

关键词：移植物转染 ctla4ig基因大鼠小肠移植排斥反应预防作用

腺病毒介导的ctla4ig基因对共同导入的LacZ基因在致敏大鼠脊髓表达的影响

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腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的LacZ基因在致敏大鼠脊髓表...

作者：张斌河北医科大学

学位级别：硕士

目的:周围神经损伤是临床上常见疾病,周围神经损伤的显微外科修复技术已经十分精湛,却长期以来难以获得满意结果。随着分子生物学和基因转移技术不断进步,神经损伤的基因治疗研究正在兴起。应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)为... 详细信息

目的:周围神经损伤是临床上常见疾病,周围神经损伤的显微外科修复技术已经十分精湛,却长期以来难以获得满意结果。随着分子生物学和基因转移技术不断进步,神经损伤的基因治疗研究正在兴起。应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)为载体将各种神经营养因子基因转入脊髓以保护受损的神经元和促进周围神经再生的研究,已成为神经修复研究领域的前沿课题。基因治疗的效果依赖于将目的基因特异、高效和安全的转染受损神经元及神经并高效表达,但由于宿主对病毒载体的免疫反应,使导入的基因不能在体内长时间高水平表达,从而限制了导入基因的治疗作用的发挥。此技术最终应用于人类,而人类大部分在一生开始的几年中被野生型的腺病毒感染。因此,在相当多的应用腺病毒载体的基因治疗的临床应用中,为了分析和控制对载体得免疫反应用病毒预先致敏动物是非常重要的。本实验为了提高腺病毒介导的基因表达,将携带LacZ基因的AdV (AdLacZ)与不带外源基因的Ad0或与携带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin , ctla4ig )基因的AdV (Adctla4ig)两种腺病毒混悬液通过微量注射导入已被腺病毒致敏的大鼠腰膨大脊髓实质内,比较共同转染Adctla4ig后β-gal在脊髓表达水平变化;并通过对大鼠血清抗病毒抗体和中和抗体滴度检测,以探讨ctla4ig诱导机体对AdLacZ的免疫耐受的作用及其机理。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠120只,体重200～250g。将大鼠随机分成两组,每组60只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天,在胸背侧皮下注射AdLacZ进行预处理。对照组(A组)导入AdlacZ+Ad0,实验组(B组)导入AdlacZ+Adctla4ig。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约3cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧1mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(A组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和Adctla4ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。两组在转染病毒后5个不同的时间点大鼠心脏取血3.5ml;在转染后5个不同时间点,对两组动物脊髓进行厚50μm的连续冰冻横切片,计数A组与B组中X-gal染色阳性的切片数,分析比较两组LacZ基因在脊髓表达的高峰期和持续时间;并检测血清抗病毒中和抗体滴度;用多聚酶链式反应(PCR)检测腺病毒注入后在血中消失时间。结果:1 X-gal, ctla4ig转基因表达:LacZ基因和ctla4ig基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.5cm区段,表达高峰时有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤120片。切片观察可见A组的X-gal染色阳性表达时间约为30天;而B组的X-gal染色阳性表达时间约为60天。脊髓阳性切片计数显示两组β-gal在脊髓表达的高峰期均在9～15天,统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数有显著差异(P基因在脊髓表达的时间明显延长。2抗病毒中和抗体滴度测定:从用AdLacZ预先皮下致敏的大鼠收集的阳性对照血清证实中和抗体的效价≥1:128,A组转染病毒后第15天血清中可检测到低效价抗病毒中和抗体(1:4),并一直持续至30天。B组在转染后第30天,血清中可检测到低效价抗病毒中和抗体(1:4),并一直持续至60天。与A组相比B组抗体滴度水平低,并且血中产生中和抗体持续在一个很低水平。在统计学上两组有显著差异(Pctla4ig基因注射入脊髓能有效地抑制局部T淋巴细胞的浸润,从而减轻由AdV介导的局部炎症反应,抑制机体对病毒载体的排斥反应,显著延长LacZ基因在脊髓的表达时间,并且能明显增强与其共同导入的LacZ基因表达强度。而且Adctla4ig对体液免疫应答有明显的抑制作用,能明显延长腺病毒在体内的存留时间。

关键词：腺病毒 ctla4ig基因脊髓抗病毒中和抗体 LacZ基因致敏

腺病毒介导的ctla4ig基因对共同导入的其他外源性基因在脊髓表达的影响

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腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的其他外源性基因在脊髓表达...

作者：孔令伟河北医科大学

学位级别：硕士

目的:应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)为载体将各种神经营养因子基因转入脊髓以保护受损的神经元和促进周围神经再生的研究,已成为神经修复研究领域的前沿课题。基因治疗的效果依赖于将目的基因特异、高效和安全的转染受损神... 详细信息

目的:应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)为载体将各种神经营养因子基因转入脊髓以保护受损的神经元和促进周围神经再生的研究,已成为神经修复研究领域的前沿课题。基因治疗的效果依赖于将目的基因特异、高效和安全的转染受损神经元及神经并高效表达,但由于宿主对病毒载体的免疫反应,使导入的基因不能在体内长时间高水平表达,从而限制了导入基因的治疗作用的发挥。本实验将将携带LacZ基因的AdV (AdLacZ)与不带外源基因的Ad0或与携带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte- associated antigen 4immunoglobulin,ctla4ig )基因的AdV (Adctla4ig)通过微量注射导入大鼠腰膨大脊髓实质内,比较共同转染Adctla4ig后β-半乳糖苷酶(β-gal)在脊髓表达水平变化;并通过对脊髓淋巴细胞亚群分类染色的观察、血清抗病毒抗体和中和抗体滴度检测,以探讨ctla4ig对AdLacZ表达的影响及其诱导机体的免疫耐受的作用和机理。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠160只,体重200～250g。将大鼠随机分成两组,每组80只。对照组(A组)导入AdlacZ+Ad0 ,实验组( B组)导入AdlacZ+Adctla。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉旁开0.8mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(A组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和Adctla(5×109 pfu/ml)各1μl(B组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。两组在转染病毒后12个不同的时间点鼠尾静脉取血2ml;在转染后10个不同时间点,对两组动物脊髓进行厚50μm的连续冰冻横切片,计数A组与B组中5-溴-4-氯-3-吲-口杂-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside X-gal )染色阳性的切片数,分析比较两组LacZ基因在脊髓表达的高峰期和持续时间;检测血清抗病毒中和抗体滴度;通过脊髓切片淋巴细胞亚群分类染色,观察CD68、CD4和CD8淋巴细胞的浸润情况。统计学方法:应用SPSS12.0软件,所得数据用均数±标准差表示,组间行成组比较t检验。P值ctla对AdLacZ在脊髓表达的影响:A组在转染后第一天即可观察到β-gal的表达,蓝染仅限于细胞核。转染后第2天胞体和突起逐渐被蓝染,转染的细胞数逐渐增多。转染的高峰期为2～8天,持续时间为2周。B组在转染后第一天即可观察到β-gal和ctla4ig的表达,转染的高峰期为2～8天,B组的X-gal染色阳性表达时间约为4周。Adctla和AdLacZ基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.6cm区段,有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤240片。转基因神经元在注射同侧表达较对侧强烈。脊髓阳性切片计数显示两组β-gal在脊髓表达的高峰期均在2～8天,统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数无显著差异(P>0.05)。2共同转染的Adctla在脊髓对细胞免疫的影响:淋巴细胞亚群分类染色观察:A组在病毒导入后24小时内即出现CD68浸润,2天后开始出现CD8淋巴细胞浸润,3天时开始出现极少量CD4淋巴细胞浸润。病毒导入后6天CD68逐渐消退,免疫反应则以CD8淋巴细胞浸润为主,伴有极少量CD4细胞浸润。在转染后第8天CD8细胞逐渐增多,2周时达高峰,其浸润程度较B组严重;持续到第6周时仍有少量浸润。B组病毒转染后1～6天,脊髓内CD68、CD8和CD4细胞的浸润程度与A组相似。在转染后第8天CD8细胞亦逐渐增多,2周达高峰;持续到第4周CD4、CD8细胞基本消退。两组CD4细胞8天后均稍有增加但浸润的数量都很少,并且与CD8消退的时间基本一致。3共同转染的Adctla在脊髓对细胞免疫的影响:抗病毒中和抗体滴度测定:A组转染病毒后第3天血清中可检测到抗病毒中和抗体,逐渐增加至第3周达到高峰并一直稳定在这一水平直至第6周。B组在转染后第3天,抗病毒中和抗体同样也被检测出,逐渐增加至第4周达到高峰并一直稳定在这一水平直至第6周。与A组相比B组抗体滴度水平稍低,但在统计学上两组无显著差异(P>0.05)。

关键词：腺病毒 ctla4ig基因脊髓淋巴细胞亚群分类抗病毒中和抗体

携带ctla4ig基因腺病毒载体对共同导入致敏大鼠脊髓的LacZ基因表达的影响

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携带CTLA4Ig基因腺病毒载体对共同导入致敏大鼠脊髓的LacZ基因表...

作者：武永富河北医科大学

学位级别：硕士

目的:随着社会的发展,各种创伤发生越来越多,伴随的神经系统损伤的数量也迅速的增加。但由于神经系统修复的复杂性和特殊,神经系统损伤的修复至今仍是一个非常棘手的难题。随着分子生物学的发展,对于神经系统损伤的修复采用基因治疗的方... 详细信息

目的:随着社会的发展,各种创伤发生越来越多,伴随的神经系统损伤的数量也迅速的增加。但由于神经系统修复的复杂性和特殊,神经系统损伤的修复至今仍是一个非常棘手的难题。随着分子生物学的发展,对于神经系统损伤的修复采用基因治疗的方法,将外源性的神经营养因子的基因通过载体定向的导入神经断端,利用受体细胞长期的高效的分泌神经营养因子,促进神经再生轴突的生长,从而促进神经损伤的修复,以期获得良好的效果。虽然利用转基因技术为神经的损伤修复提供了一个非常好的方向,但由于受体对外源性基因及载体的免疫排斥作用,使得外源性基因的长期高效的表达不能实现,这也就限制了神经修复的效果。针对这一瓶颈,本实验采用导入带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 immunoglobulin, ctla4ig)基因腺病毒AdV(Ad ctla4ig)和携带LacZ基因的AdV(AdLacZ)微量注射器共同导入大鼠脊髓腰膨大处作为实验组,将未携带外源性基因的Ad0和携带LacZ基因的AdV(AdLacZ)通过微量注射器共同导入大鼠脊髓腰膨大处作为对照组,两组通过比较β-gal在脊髓表达的变化,并通过多聚酶链反应(PCR)监测腺病毒注入后在脊髓量的变化及消失时间和用逆转录多聚酶链反应(PT-PCR)法检测ctla4ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表达,以探讨ctla4ig诱导机体对AdLacZ的局部免疫耐受的作用及其机理。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠54只,体重200～250g。将大鼠随机分成四组,A,B每组21只,C,D组每组6只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天,在胸背侧皮下注射AdLacZ 1μl进行预处理。对照组(A组、C组)导入AdlacZ+Ad0,实验组(B组、D组)导入AdlacZ+Adctla4ig。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约3cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧1mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(A组、C组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和Adctla4ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B组、D组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗切口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭切口。逐层关闭切口,结束手术。自然条件下恢复清醒,相同条件下喂养进行观察。C组和D组于距第一次手术30天后于脊髓后正中动脉左侧1mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(C组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和Adctla4ig(5×109 pfu/ml)各1μl(D组)。其余手术方法相同。实验组和对照组在转染腺病毒后的9时间点取大鼠脊髓注射点远近端5mm的腰膨大节段,注射点头侧5mm的脊髓节段进行厚50μm的连续冰冻横切片,对实验组和对照组中X-gal染色阳性的切片进行计数,并通过多聚酶链反应(PCR)监测腺病毒注入后在脊髓量的变化及消失时间,用逆转录多聚酶链反应(PT-PCR)法检测ctla4ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表达情况。结果:1 X-gal, ctla4ig转基因表达:LacZ基因和ctla4ig基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.5cm区段,表达高峰时有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤120片。切片观察可见实验对照组的X-gal染色阳性表达时间约为15天;而实验组的X-gal染色阳性表达时间约为60天。实验组脊髓阳性切片计数显示β-gal在脊髓腰膨大表达的高峰期均在4天和9天,15天后β-gal在脊髓腰膨大X-gal染色阳性表达量逐步减少,在60天仍能见到低表达量。统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数有显著差异(P基因在脊髓表达的时间明显延长。2腺病毒液PCR检测:腺病毒的表达量随着浓度的降低而逐渐减小。采用病毒液10倍系列稀释提取后DNA经PCR反应可检测出腺病毒的特异性条带的最低稀释度为104。AdlacZ(1×109pfu/ml)与Ad0(5×109 pfu/ml)特异性条带的最低稀释度一致。3脊髓标本腺病毒PCR检测:用PCR法从DNA水平分别检测腺病毒在实验对照组、实验组的表达情况,腺病毒的DNA量是随时间延长逐渐下降的,实验对照组至39天检测不到腺病毒的表达,实验组60天时仍能检测到腺病毒的表达。4 RT-PCR实

关键词：腺病毒 ctla4ig基因脊髓 LacZ基因致敏

ctla4ig基因转染对大鼠胰岛移植的影响

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第三军医大学学报 2000年第5期22卷 433-435页

作者：金世龙顾红光王亚旭刘宝华文亚渊王仁云王东何培生第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科重庆400042

目的　研究ctla4ig基因在糖尿病大鼠体内表达及其产物延长胰岛移植物存活的作用。方法　利用Lipofectin载体包裹ctla4igcDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞 ,检测移植后ctla4ig基因表达水平 ,观察ctla4ig基因表达在延长糖尿病鼠胰岛移植物... 详细信息

目的　研究ctla4ig基因在糖尿病大鼠体内表达及其产物延长胰岛移植物存活的作用。方法　利用Lipofectin载体包裹ctla4igcDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞 ,检测移植后ctla4ig基因表达水平 ,观察ctla4ig基因表达在延长糖尿病鼠胰岛移植物和大鼠存活时间的作用。结果　A组胰岛移植第 7天 2只大鼠血清ctla4ig呈阳性 (阳性率 2 0 % ) ,分别为 14ng ml和 31ng ml。B组胰岛移植后维持血糖正常时间平均 (3 .6± 5 .1)d ,A组胰岛移植后维持血糖正常平均 (14 .8± 12 .3)d ,两组比较差异显著 (P 4.0± 10 .8)d ,最长 45d ,B组大鼠平均存活 (10 .8± 4.8)d ,最长 2 1d ,两组大鼠生存时间差异非常显著 (P ctla4ig基因可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织表达。

关键词：胰岛移植基因治疗糖尿病大鼠 ctla4ig基因

重组腺病毒介导的ctla4ig基因在哺乳动物体内表达的研究

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重庆医学 2002年第8期31卷 672-673页

作者：杨世昕吴军易绍萱罗高兴贺伟峰黄赤兵周立新马兵张宁陈希炜第三军医大学西南医院烧伤研究所重庆400038

目的　了解ctla4ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法　用所构建的ctla4ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测ctla4ig在以上动物血清中的表达情况 ,同... 详细信息

目的　了解ctla4ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法　用所构建的ctla4ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测ctla4ig在以上动物血清中的表达情况 ,同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果　重组腺病毒转染 7d后大鼠、小鼠血清中出现ctla4ig ,持续表达 2周。各动物未见异常死亡 ,各脏器未见明显病理改变。结论　ctla4ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠。

关键词：重组腺病毒 ctla4ig基因哺乳动物体内表达移植排斥反应基因治疗

ctla4ig基因在延长大鼠移植胰岛存活中的作用

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中华普通外科杂志 2000年第5期15卷 309-310页

作者：金世龙顾红光王亚旭刘宝华文亚渊王仁云王东何培生第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科重庆400042

人ctla4ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

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第三军医大学学报 2002年第7期24卷 782-785页

作者：贺伟峰吴军易绍萱罗高兴陈希炜郑峻松马兵雷晓第三军医大学附属西南医院全军烧伤研究所重庆400038

目的　构建并鉴定人ctla4ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与ctla4ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pctla4ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8... 详细信息

目的　构建并鉴定人ctla4ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法　利用基因重组技术将IRES序列与ctla4ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pctla4ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达ctla4ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定ctla4ig生物学活性。结果　成功构建出含IRES序列的ctla4ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明ctla4ig生物学活性没有受到影响。

关键词：逆转录病毒载体 ctla4ig基因 EGFP基因 IRES2 逆转录病毒双基因共表达基因重组脂质体法增强型绿色荧光蛋白