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Combination of ctla4-fasl gene transfer and allogeneic bone marrow transplantation led to durable macrochimerism and donor-specific tolerance in mouse model

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Science Bulletin 2005年第20期 57-63页

作者： FENG Yougang1, WANG Guangming2, HAO Jie2, LI Ailing2, YUAN Guohong2, LI Chong2, ZENG Fuqing1 & XIE Shusheng2 1. Institute of Urology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China 2. Department of Immunology, Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China

Mixed hemopoietic chimerism is capable of inducing donor specific tolerance, thus eliminating the chronic immunosuppressive therapy following organ trans- plantation. As yet no safe and effective tolerance protocol is available for clinical implementation. Here we describe an alternative nonmyeloablative based strategy of using a single injection of recombination adenovirus vector encoding ctla4-fasl fusing gene and donor bone marrow cells to promote durable mixed macrochimerism (>20% on 140 d). Chimeras exhibited robust donor-specific tolerance, as evi- denced by acceptance of fully allogeneic skin grafts (the mean survival time (MST)>200 d) and rejection of third- party skin grafts in a normal manner (MST4 after transplantation, suggesting that ctla4-fasl led to rapid systemic peripheral tolerance to facilitate the bone marrow engraftment, while both HTLp and CTLp remained at low level only in recipient mice with mixed chimerism on day 140 after transplantation, demon- strating that long-term skin grafts tolerance was associated with stable mixed chimerism, and central deletion of donor specific T cell may be the main mechanism for tolerance maintenance.

关键词： transplantation tolerance mixed macrochimerism ctla4-fasl gene transfer skin transplantation.

大鼠ctla4-fasl融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

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免疫学杂志 2011年第12期27卷 1078-1082,1085页

作者：王博王芳张瑾于继云张巍吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院基础医学研究所转化医学研究室北京100850

目的检测大鼠ctla4-fasl重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠ctla4-fasl融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利... 详细信息

目的检测大鼠ctla4-fasl重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠ctla4-fasl融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠ctla4-fasl融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的ctla4-fasl重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达ctla4-fasl融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。

关键词：重组腺相关病毒 ctla4-fasl 成纤维样滑膜细胞表达

肌肉注射ctla4-fasl重组腺相关病毒抑制大鼠关节炎的实验研究

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免疫学杂志 2012年第10期28卷 858-861,876页

作者：张晓郡王芳王博高燕于继云徐元基阎瑾琦王宇张巍广西医科大学免疫学研究室南宁530021 军事医学科学院基础医学研究所转化医学研究室北京100850

目的观察ctla4-fasl融合基因能否有效抑制大鼠关节炎。方法在动物造模免疫第2天,以肌肉注射方式导入ctla4-fasl和EGFP(对照)重组腺相关病毒(rAAV),持续观察和测量2组动物的临床指标包括关节指数、踝关节厚度和体质量等,并对踝关节的组... 详细信息

目的观察ctla4-fasl融合基因能否有效抑制大鼠关节炎。方法在动物造模免疫第2天,以肌肉注射方式导入ctla4-fasl和EGFP(对照)重组腺相关病毒(rAAV),持续观察和测量2组动物的临床指标包括关节指数、踝关节厚度和体质量等,并对踝关节的组织学表现如滑膜增生和炎性细胞浸润等进行了检测。结果应用大鼠佐剂诱导关节炎动物模型,明确了重组AAV病毒可介导目的基因ctla4-fasl于体内表达;与rAAV.EGFP对照组相比,rAAV.ctla4-fasl处理组在临床学和组织学表现上均有效抑制了大鼠关节炎。结论 ctla4-fasl融合分子很可能是具有潜在研究价值的类风湿性关节炎治疗分子。

关键词：重组腺相关病毒 ctla4-fasl 类风湿性关节炎动物模型

腺病毒载体介导的ctla4-fasl基因转移联合应用供者脾细胞输注促进异基因小鼠皮肤移植耐受

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中国免疫学杂志 2005年第4期21卷 257-261页

作者：王光明杨阳李爱玲郝洁高翔谢蜀生北京大学医学部免疫学系北京100083

目的:探讨腺病毒介导ctla4 -fasl基因转移联合应用供者脾细胞输注延长小鼠皮肤移植物存活的作用及其机制。方法:在移植的第0天,C5 7BL 6 (H 2 b,B6 )小鼠经尾静脉注射BALB c(H 2 d)小鼠脾细胞和5×10 9空斑形成单位毫升(pfu ml)ctla4 ... 详细信息

目的:探讨腺病毒介导ctla4 -fasl基因转移联合应用供者脾细胞输注延长小鼠皮肤移植物存活的作用及其机制。方法:在移植的第0天,C5 7BL 6 (H 2 b,B6 )小鼠经尾静脉注射BALB c(H 2 d)小鼠脾细胞和5×10 9空斑形成单位毫升(pfu ml)ctla4 - fasl重组腺病毒(Adctla4 - fasl) ,同一天进行皮肤移植,每天观察移植物存活情况。耐受小鼠尾静脉取血,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定ctla4 fasl融合蛋白的体内表达;于第2 0天对受体小鼠进行迟发型超敏反应、单向混和淋巴细胞反应(MLR)、IL- 2逆转试验、过继转移实验和嵌合体检测等耐受状态的检测,以探讨耐受机制。结果:经尾静脉输注供体脾细胞及Adctla4 - fasl的B6小鼠,皮肤移植物的平均存活时间达(42 8±2 6 )天(n =6 ) ,而对照的未处理组,绿色荧光蛋白(EGFP)腺病毒处理组,重组腺病毒Adctla4Ig组和Adctla4 fasl处理组的平均存活时间为(10 .1±0 . 4 1)天(n =6 )、(10-.5±1.4 )天(n =6 )、(12 . 8±1. 1)天(n =6 )、(2 0 .0±2 .5 )天(n =6 ) ,差异具有显著意义(P ctla4 -

关键词：皮肤移植免疫耐受 ctla4Ig ctla4-fasl 基因转移

rAAV介导ctla4-fasl融合基因对类风湿性关节炎的基因治疗研究

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rAAV介导CTLA4-FasL融合基因对类风湿性关节炎的基因治疗研究

作者：王博吉林大学

学位级别：硕士

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，主要侵犯关节腔内的滑膜组织，引起滑膜的过度增殖，甚至侵犯软骨造成骨破坏，致畸率很高，严重影响患者的生存质量和预期寿命，一直以来都是世... 详细信息

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，主要侵犯关节腔内的滑膜组织，引起滑膜的过度增殖，甚至侵犯软骨造成骨破坏，致畸率很高，严重影响患者的生存质量和预期寿命，一直以来都是世界范围内研究热点。类风湿性关节炎的病理特征为关节腔内滑膜细胞的异常增殖及炎症细胞的浸润;其发病机制不明确，致病环节及致病因素十分复杂，给研究工作带来很多困难。目前研究表明，治疗方案可分为传统中药、西药、手术及生物治疗。基因治疗可采取局部基因转移方法，在病变关节局部达到理想的蛋白质浓度，降低了正常组织和器官与外源药物接触所造成的危险。成纤维样滑膜细胞（FLSs）会显著促进类风湿性关节炎的发病。通过引进凋亡诱导物fasl抑制关节内成纤维样滑膜细胞的增殖，为RA的治疗提供了一种有效的方法。而T淋巴细胞是一种对类风湿关节炎的发病机理非常重要的炎症细胞，所以针对T淋巴细胞生物治疗也可以提供一个治疗类风湿性关节炎较有效率的方法。细胞毒T细胞相关抗原4（ctla4）可以抑制自身反应性T细胞的活化，并使其进入无能;而fasl则可以上调Fas抗原调节的凋亡信号，从而诱导滑膜细胞凋亡，抑制滑膜炎症。ctla4-fasl融合基因整合了ctla4和fasl的胞外区基因，一方面通过ctla4功能域抑制自身反应性T细胞激活;另一方面，对逃脱抑制的活化细胞，通过fasl功能域诱导其凋亡从而实现多途径抑制和清除自身反应性T细胞，成为具有治疗RA治疗潜能分子。在本研究中，我们探讨ctla4-fasl蛋白对RA动物模型的治疗效果，及其在细胞模型中抑制炎性成纤维样滑膜细胞增殖和炎症的作用。我们首先构建了ctla4-fasl融合基因，并通过表达载体表达后进行纯化并验证其生物活性。然后构建了重组病毒载体pAAV.ctla4-fasl，对其进行病毒包装并初纯化。利用热灭活结核杆菌H37Ra菌株、矿物油免疫Lewis大鼠建立了佐剂诱导性关节炎（AIA）动物模型，并证明其具有关节炎的临床症状和典型的组织学特征。随后通过关节腔注射重组病毒rAAV.ctla4-fasl的方法，以增强的绿色荧光蛋白(rAAV.EGFP)作为对照，将ctla4-fasl由重组腺相关病毒载体递送到AIA大鼠关节中，通过观察并收集临床表现和病理组织学等方面数据，与对照组相比，实验组表现出明显的治疗效果，同时我们还发现通过治疗也能显著降低AIA关节中关键性炎性细胞因子的水平，而从各个方面证明重组病毒rAAV.ctla4-fasl能够对AIA大鼠的关节炎症起到显著的缓解和治疗作用。并通过实验证明ctla4-fasl蛋白与FLSs共孵育，可以明显诱导FLSs的凋亡，进一步从细胞模型上证明了ctla4-fasl蛋白对RA的治疗作用。有以上结果我们得出结论：由AAV载体介导的ctla4-fasl基因递送明显抑制RA的动物模型的关节炎症，表明通过局部关节递送ctla4-fasl治疗RA具有潜在的应用前景。

关键词：类风湿性关节炎重组腺相关病毒 ctla4-fasl 成纤维样滑膜细胞佐剂诱导性关节炎

ctla4-fasl融合基因有效抑制动物关节炎的实验研究

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CTLA4-FasL融合基因有效抑制动物关节炎的实验研究

重组腺病毒Adctla4-fasl联合供者骨髓细胞输注促进混合嵌合体形成和小鼠皮肤移植耐受

第八届全国免疫学学术大会

研究背景:类风湿性关节炎( RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其病理学特征表现为大量炎症细胞浸润关节滑膜,产生滑膜炎并导致关节软骨和骨破坏。近年大量研究证据表明T细胞是浸润到 RA滑膜中的主要炎症细胞,在 RA发病机制中发挥中心作用,... 详细信息

研究背景:类风湿性关节炎( RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其病理学特征表现为大量炎症细胞浸润关节滑膜,产生滑膜炎并导致关节软骨和骨破坏。近年大量研究证据表明T细胞是浸润到 RA滑膜中的主要炎症细胞,在 RA发病机制中发挥中心作用,因此抑制引起自身免疫反应的T细胞活化或增殖,已成为治疗 RA的有效新途径。ctla4-Ig通过阻断共刺激信号而抑制T细胞激活,然而其对共刺激通路的干扰只能抑制但不能清除自身反应性T细胞,而且其诱导的T细胞无能是可以发生逆转的,因此对 RA负调节能力有限,需要改进。Fas L:Fas信号在活化诱导的T细胞死亡中发挥关键作用,由于 RA自身反应性T细胞的Fas L表达水平很低,使得炎症T细胞逃避凋亡而过度增殖;通过引入Fas L分子,上调Fas介导的T细胞凋亡,很可能是消除或拮抗T细胞的有效策略;然而体内注射可溶性Fas L会产生强烈肝毒性(甚至造成处理动物死亡),因此需要对s Fas L进行改造。目的:ctla4-Fas L分子将以上两个抗炎功能元件整合在一起,很可能作为理想的ctla4-Ig或Fas L衍生物而对 RA治疗有效。方法:腺相关病毒(AAV)具有安全性好、能介导目的基因长期稳定表达等优点,本研究借助重组AAV2,于关节内递送目的基因,观察其对大鼠佐剂诱导关节炎(AIA)的抑制作用。结果:从大鼠脾细胞中克隆并搭建ctla4-Fas L融合基因,纯化目的蛋白,细胞模型研究表明融合蛋白可与B7+和Fas+细胞结合并抑制T淋巴细胞增殖;关节内注射r AAV.ctla4-Fas L(以r AAV.EGFP为对照)可有效降低大鼠关节炎的关节指数、踝关节厚度、后爪的肿胀体积等临床参数,明显阻止滑膜增生、炎性细胞浸润、关节软骨和骨破坏等组织学变化,并显著降低AIA踝关节中关键促炎细胞因子的蛋白水平。随后的进一步研究结果表明,ctla4-fasl蛋白对从大鼠关节炎滑膜中分离的成纤维样滑膜细胞(促使滑膜增生的主要细胞类型)具有诱导凋亡、抑制增殖活性;动物模型研究表明,无论在临床表现还是组织学观察上,ctla4-fasl融合分子都比单独fasl分子能更有效地抑制AIA。结论:关节注射r AAV.ctla4-Fas L显著抑制AIA,提示关节局部递送ctla4-Fas L基因对于抑制 RA具有潜在的应用价值。

关键词：类风湿性关节炎动物模型 ctla4-fasl 基因治疗

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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科学通报 2005年第19期50卷 2092-2097页

作者：奉友刚王光明郝洁李爱玲袁国红李翀曾甫清谢蜀生华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科研究所武汉430022 北京大学医学部免疫学系北京100083

在不对受体去髓处理的情况下,用重组腺病毒Adctla4-fasl结合供者骨髓移植诱导混合嵌合体和同种皮肤移植耐受,结果显示,获得了持久宏嵌合体(macrochimerism)(140d时,供体细胞>20%).同时,这种嵌合体促进了稳定的供体特异性耐受,BALB/c小... 详细信息

在不对受体去髓处理的情况下,用重组腺病毒Adctla4-fasl结合供者骨髓移植诱导混合嵌合体和同种皮肤移植耐受,结果显示,获得了持久宏嵌合体(macrochimerism)(140d时,供体细胞>20%).同时,这种嵌合体促进了稳定的供体特异性耐受,BALB/c小鼠的皮肤移植物在B6受体小鼠中长期存活(平均存活时间(themeansurvivaltime,MST)大于200d),而来源于ICR小鼠的第三者皮肤移植物被该嵌合体小鼠正常排斥.用该方法处理的B6小鼠在接受皮肤移植14d后,辅助性T淋巴细胞前体(HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体(CTLp)的频数降低到很低的水平,表明Adctla4-fasl能够迅速促进全面的外周耐受,从而有利于供体骨髓细胞植入.接受皮肤移植140d后,供体皮肤仅在形成长期嵌合体的受体小鼠中继续存活,这些小鼠体内供体特异性的HTLp和CTLp的频数减少,提示长期的皮肤移植物耐受与稳定的混合嵌合体有关,中枢性T细胞删除可能是耐受维持的主要机制.

关键词：移植耐受混合嵌合体 ctla4-fasl 基因转移皮肤移植 BALB/c小鼠重组腺病毒骨髓细胞嵌合体耐受

共刺激通路阻断剂在角膜移植排斥治疗中的应用

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国外医学：眼科学分册 2005年第2期29卷 76-79页

作者：陈敏史伟云山东省眼科研究所青岛研究生266071

共刺激通路阻断剂是利用分子生物学方法重组免疫调节分子,人为干预免疫应答,以抑制特异性T细胞免疫反应,在诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中显示了良好的应用前景。本文针对角膜组织的免疫学特点及共刺激通路阻断剂如ctla4 Ig、CD4 ... 详细信息

共刺激通路阻断剂是利用分子生物学方法重组免疫调节分子,人为干预免疫应答,以抑制特异性T细胞免疫反应,在诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中显示了良好的应用前景。本文针对角膜组织的免疫学特点及共刺激通路阻断剂如ctla4 Ig、CD4 0Ig、抗CD15 4mAb、ctla4 fasl在角膜移植排斥治疗中的应用进行综述。

关键词：共刺激通路排斥治疗角膜移植阻断剂 ctla4-fasl ctla4-Ig 分子生物学方法自身免疫性疾病免疫调节分子细胞免疫反应免疫学特点免疫应答移植耐受角膜组织特异性