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猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

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中国农学通报 2005年第3期21卷 12-14,26页

作者：孙裴张彦明魏中锋倪斌洪海霞张永国郭抗抗王晶钰西北农林科技大学动物科技学院陕西杨陵712100

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以csfvShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。

关键词：重组质粒真核表达质粒基因细胞毒阳性真核表达载体套式PCR 猪瘟病毒 csfv 位点

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2中和表位的定位及其免疫反应性分析

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病毒学报 2005年第2期21卷 118-123页

作者：张富强李志华张念祖云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

猪瘟病毒(csfv)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。Erns和E2与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程。采用抗csfv中和性单克隆抗体c24/10,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,结合噬菌体拟位免疫反应性... 详细信息

猪瘟病毒(csfv)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。Erns和E2与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程。采用抗csfv中和性单克隆抗体c24/10,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,结合噬菌体拟位免疫反应性分析结果,对csfvE2蛋白中和表位进行定位。结果表明:E2蛋白的SPT-TLR基序(832～837位氨基酸)构成csfv特异性线性中和表位,基序的第一、二、三位氨基酸是表位与单克隆抗体c24/10结合所必需的氨基酸,也是表位的关键性氨基酸。

关键词：表位免疫反应性囊膜膜糖蛋白单克隆抗体保护性免疫应答糖蛋白E csfv 猪瘟病毒氨基酸

猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用

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畜牧兽医学报 2012年第9期43卷 1429-1436页

作者：刘志杰曾智勇汤德元周莉梁海英肖超能贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 贵州大学教学实验场贵阳550025

参照GenBank中相关的基因序列,设计了6对引物分别用于扩增PRV gE、PPV NS1、PCV ORF2、PRRSV ORF7、csfvE2、JEVE基因的部分片段。敏感性和特异性试验结果表明,该mPCR对6种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 6.6pg、PPV 96pg、PCV 12.9pg、... 详细信息

参照GenBank中相关的基因序列,设计了6对引物分别用于扩增PRV gE、PPV NS1、PCV ORF2、PRRSV ORF7、csfvE2、JEVE基因的部分片段。敏感性和特异性试验结果表明,该mPCR对6种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 6.6pg、PPV 96pg、PCV 12.9pg、PRRSV 10.5pg、csfv 51pg、JEV 46pg,对猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌(***)的扩增结果均为阴性。103份临床病料检测结果表明,上述6种猪病毒性疫病在贵州省猪群中普遍存在且混合感染情况严重。该六重PCR方法不仅实现了上述6种病毒的同时检测,更实现了DNA病毒及RNA病毒的同步检测,能够对PRV、PPV、PCV、PRRSV、csfv、JEV单个或混合感染的临床病料进行快速鉴别诊断。

关键词： PRV PPV PCV2 PRRSV csfv JEV 多重PCR

猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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华北农学报 2010年第6期25卷 38-43页

作者：路斌王一成吴润袁秀芳徐丽华李军星王朝文甘肃农业大学甘肃兰州730070 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

通过对Genbank登录的csfv、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出csfv的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+... 详细信息

通过对Genbank登录的csfv、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出csfv的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测csfv、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为csfv(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对csfv、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。

关键词： csfv PRRSV JEV 多重二温式PCR

猪瘟病毒在PK细胞和MPK细胞中繁殖过程的研究

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微生物学报 1999年第3期39卷 189-195页

作者：王镇陆宇周鹏程翟中和丁明孝北京大学生命科学学院

以猪瘟病毒疫苗Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ株（Ｔ株）为实验材料，研究该病毒株在ＰＫ１５细胞中增殖的基本特性与规律。在ＰＫ１５细胞中，猪瘟病毒Ｔ株在感染后１２ｈ即可检测到子代病毒粒子。接毒后４８ｈ，几乎所有的细胞都被病毒感染... 详细信息

以猪瘟病毒疫苗Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ株（Ｔ株）为实验材料，研究该病毒株在ＰＫ１５细胞中增殖的基本特性与规律。在ＰＫ１５细胞中，猪瘟病毒Ｔ株在感染后１２ｈ即可检测到子代病毒粒子。接毒后４８ｈ，几乎所有的细胞都被病毒感染；到６０ｈ，释放到培养液中有活性的病毒粒子达到最高峰，为１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ。培养液中的病毒粒子在３７℃半寿期只有３个小时。同时，建立了ＭＰＫ细胞ＣＳＦＶＴ株的感染模式，其ＣＳＦＶ的滴度可达１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ。在此基础上，用抗ＣＳＦＶ包膜蛋白Ｅ２和非结构蛋白ｐ１２０的单克隆抗体显示了病毒在细胞中增殖的部位。

关键词：猪瘟病毒 csfv 免疫荧光形态结构

猪六种重要病原寡核苷酸芯片检测方法的初步建立

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中国兽医科学 2016年第2期46卷 142-148页

作者：保雨聂福平杨俊王昱刘亚娟王国民李贤良李应国张超刘力西南大学动物科技学院重庆400715 重庆出入境检验检疫局/重庆市进出口食品安全工程中心重庆400020 重庆大学生物工程学院重庆400030

为建立同时鉴别检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）、副猪嗜血杆菌（HPS）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体（Mhp）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（csfv）这6种病原的寡核苷酸芯片方法,根据这6种病原的特异保守... 详细信息

为建立同时鉴别检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）、副猪嗜血杆菌（HPS）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体（Mhp）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（csfv）这6种病原的寡核苷酸芯片方法,根据这6种病原的特异保守序列,设计了6对特异性引物和探针,建立多重PCR体系,优化杂交参数,进行方法评估。结果显示,该方法检测APP、HPS、Mhp、PCV2、PRRSV及csfv的灵敏度分别为5.8×10^2copies/L、7.8×10^3copies/L、6.8×10^3copies/L、6.3×10^2copies/L、4.8×10^3copies/L、5.5×10^2copies/L,且与猪源伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒及沙门菌等9种病原无交叉反应。用建立的多重PCR对186份临床样本的检测结果显示,单一感染率为18.3%（34/186）,混合感染率为5.9%（11/186）,与测序验证完全一致。该方法为多种病原的流行病学调查和临床诊断提供了一种快速、高通量的检测手段。

关键词：寡核苷酸芯片 APP HPS Mhp PCV2 PRRSV csfv

猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

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西北农业学报 2018年第9期27卷 1273-1279页

作者：袁莉杨顺利尚佑军贾怀杰景志忠刘湘涛蔡建平尹双辉中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(csfv)结构蛋白E0和C为抗原,建... 详细信息

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(csfv)结构蛋白E0和C为抗原,建立检测血清抗体的间接ELISA方法,评价其敏感性和特异性,并检测疫苗免疫过程中抗E0和C蛋白抗体的消长规律。结果显示:csfv-E0和csfv-C间接ELISA抗体检测方法的抗原最佳包被质量浓度分别为2.09和1.59μg/mL,待检血清样本最适稀释度分别为1∶60和1∶80,酶标二抗稀释度分别为1∶100和1∶350,2种ELISA方法与常见猪病原的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。CSF疫苗免疫后第7天即可检测到抗E2、E0和C蛋白的抗体,其中抗E2和E0的抗体在免疫后第21天达到最高水平,E2抗体滴度先上升后下降,E0抗体在免疫后第21天开始下降并最终趋于稳定;C蛋白抗体在免疫后第7天出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。结果表明,利用重组抗原建立的csfv血清抗体ELISA检测方法,可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点,从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。

关键词： csfv 结构蛋白疫苗免疫抗体检测间接ELISA

密码子优化的猪瘟病毒荧光抗体的表达及初步应用

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南京农业大学学报 2017年第2期40卷 295-301页

作者：何辉乔绪稳陈瑾于晓明张元鹏侯继波郑其升孙卫东南京农业大学动物医学院江苏南京210095 国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

[目的]本文旨在研究大肠杆菌表达的猪瘟病毒(csfv)荧光抗体用于病毒直接免疫荧光检测的可行性。[方法]在基因水平上对编码猪瘟病毒纳米抗体(VHH)与绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因进行密码子优化,优化后的融合基因插入p ET32a(+)载体并在... 详细信息

[目的]本文旨在研究大肠杆菌表达的猪瘟病毒(csfv)荧光抗体用于病毒直接免疫荧光检测的可行性。[方法]在基因水平上对编码猪瘟病毒纳米抗体(VHH)与绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因进行密码子优化,优化后的融合基因插入p ET32a(+)载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达。表达的融合蛋白经过SDS-PAGE、Western blot进行表达及可溶性鉴定。利用镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,经浓缩后用于猪瘟病毒直接免疫荧光检测并与csfv间接免疫荧光试验进行效果比较,将该荧光抗体孵育csfv、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)感染的PK15细胞从而鉴定荧光抗体的特异性。[结果]SDS-PAGE结果表明荧光抗体在大肠杆菌中实现部分可溶性表达。特异性试验结果表明,只有接种csfv的PK15细胞组出现明显的绿色荧光,而其他组不出现或只出现少量非特异性荧光。与用商品化单抗建立的间接免疫荧光试验结果相比,该荧光抗体建立的直接免疫荧光方法具有更强的清晰度。[结论]猪瘟荧光抗体可在大肠杆菌中高效表达,纯化后的抗体具有良好的特异性,且该抗体具有生产操作简单、制备周期短和成本低等特点。

关键词： csfv 荧光抗体原核表达直接免疫荧光

1986--2011年广西猪瘟流行监测及遗传变异分析

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中国兽医学报 2013年第10期33卷 1481-1487页

作者：谭颖翌毛燕吴健敏覃绍敏马玲白安斌廖文军欧阳康周松峰动物科学技术学院广西南宁530005 广西兽医研究所广西南宁530001

采用Nested-PCR方法对采自广西各地1986-2011年间,199个猪场(养殖户)的1 521份样品进行csfv、PRRSV、PCV2、PRV、HPS等病原的检测及流行病学调查,结果发现广西猪瘟以混合感染为主,病性复杂。尽管保育猪发病仍占第1位,但近年来母猪繁殖... 详细信息

采用Nested-PCR方法对采自广西各地1986-2011年间,199个猪场(养殖户)的1 521份样品进行csfv、PRRSV、PCV2、PRV、HPS等病原的检测及流行病学调查,结果发现广西猪瘟以混合感染为主,病性复杂。尽管保育猪发病仍占第1位,但近年来母猪繁殖障碍、无症状带毒感染的发病率已明显提高。通过对25年来收集的77株广西csfv流行株E2基因的比较分析,发现广西猪瘟流行株分为基因I群和II群,目前仍未发现基因III群。起源于欧洲大陆的S2.1亚型毒株已经成为广西的优势流行株,多引起临床的急性和亚急性感染;以SHIMEN株为代表的中国经典毒株S1.1亚型是造成母猪繁殖障碍、隐性带毒感染的主要毒株。流行于20世纪80-90年代间的基因S2.2及S2.3亚型毒株已经基本消失,值得进一步研究。广西csfv流行株E2蛋白部分关键氨基酸位点已经发生变异,可能会导致疫苗的不完全保护。

关键词： csfv E2 Nested—PCR 序列分析