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Direct reprogramming of fibroblasts into functional hepatocytes via crispra activation of endogenous Gata4 and Foxa3

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中华医学杂志(英文版) 2024年第11期137卷 2024 May 9页

作者： Li Jiacheng Li Ruopu Bai Xue Zhang Wenlong Nie Yu Hu Shengshou State Key Laboratory of Cardiovascular Disease Fuwai Hospital and Cardiovascular Institute National Center for Cardiovascular Diseases Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College Beijing China Department of Obstetrics and Gynecology Beijing Advanced Innovation Center for Genomics Third Hospital School of Life Sciences Peking University Beijing China

Background: The ability to generate functional hepatocytes without relying on donor liver organs holds significant therapeutic promise in the fields of regenerative medicine and potential liver disease treatments. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) activator (crispra) is a powerful tool that can conveniently and efficiently activate the expression of multiple endogenous genes simultaneously, providing a new strategy for cell fate determination. The main purpose of this study is to explore the feasibility of applying crispra for hepatocyte reprogramming and its application in the treatment of mouse liver fibrosis.Method: The differentiation of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) into functional induced hepatocyte-like cells (iHeps) was achieved by utilizing the crispra synergistic activation mediator (SAM) system, which drove the combined expression of three endogenous transcription factors—Gata4,Foxa3, andHnf1a—or alternatively, the expression of two transcription factors,Gata4 andFoxa3.In vivo, we injected adeno-associated virus serotype 6 (AAV6) carrying the crispra SAM system into liver fibroticCol1a1-CreER;Cas9fl/fl mice, effectively activating the expression of endogenousGata4 andFoxa3 in fibroblasts. The endogenous transcriptional activation of genes was confirmed using real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and RNA-seq, and the morphology and characteristics of the induced hepatocytes were observed through microscopy. The level of hepatocyte reprogrammingin vivo is detected by immunofluorescence staining, while the improvement of liver fibrosis is evaluated through Sirius red staining, alpha-smooth muscle actin (α-SMA) immunofluorescence staining, and blood alanine aminotransferase (ALT) examination.Results: Activation of only two factors,Gata4 andFoxa3, via crispra was sufficient to successfully induce the transformation of MEFs into iHeps. These iHeps could be expandedin vitro and displayed functional characteristics similar to those of mature hepatocyte

关键词： Liver fibrosis crispra Cell reprogramming Transcriptional activation Hepatocytes

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水稻crispra系统的优化及验证

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西北农业学报 2023年第10期32卷 1587-1593页

作者：杨柳姚毅菲刘林丽苏颜琦刘华伟西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

CRISPR激活(CRISPR activation,crispra)是通过dCas9-sgRNA复合体融合或招募转录激活域至启动子区以增强基因转录的CRISPR衍生技术。为提高水稻crispra系统特异性及其激活效率,设计点突变引物将dCas9突变为特异性更强的HFdCas9,同时采用... 详细信息

CRISPR激活(CRISPR activation,crispra)是通过dCas9-sgRNA复合体融合或招募转录激活域至启动子区以增强基因转录的CRISPR衍生技术。为提高水稻crispra系统特异性及其激活效率,设计点突变引物将dCas9突变为特异性更强的HFdCas9,同时采用2×35S启动子表达密码子优化的水稻HFdCas9-TV。通过将HFdCas9-TV质粒和sgRNA质粒共转染水稻原生质体,基于OsGW7和OsF3H的相对表达量变化检测所构建的crispra系统激活效率。结果表明,该系统可激活OsGW7至对照组的95倍,为CCTV系统的2.2倍;可同时激活OsGW7、OsF3H表达量分别至对照组的33倍和26倍。该系统的建立为开发特异性更强、效率更高的植物crispra系统奠定前期试验基础,为水稻及其他作物分子育种提供“多重加法”的技术方案。

关键词：基因激活 crispra 水稻原生质体

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蓝细菌crispra系统的开发及其代谢工程应用

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合成生物学 2023年第4期4卷 824-839页

作者：王甜甜朱虹杨琛中国科学院合成生物学重点实验室中国科学院分子植物科学卓越创新中心上海200032 中国科学院大学北京100049

蓝细菌是光合作用研究的模式生物之一,也是构建光能自养细胞工厂的良好底盘。然而目前蓝细菌的遗传操作工具仍然较为缺乏且效率较低,开发高效的蓝细菌基因调控工具对于蓝细菌系统与合成生物学研究具有重要意义。本研究在模式蓝细菌聚球... 详细信息

蓝细菌是光合作用研究的模式生物之一,也是构建光能自养细胞工厂的良好底盘。然而目前蓝细菌的遗传操作工具仍然较为缺乏且效率较低,开发高效的蓝细菌基因调控工具对于蓝细菌系统与合成生物学研究具有重要意义。本研究在模式蓝细菌聚球藻PCC 7942中开发了CRISPR激活系统,测试了多个转录激活因子,将内源的RNA聚合酶ω-亚基RpoZ与无DNA切割活性的dCas9融合表达,利用高强度启动子表达向导RNA,进而敲除内源rpoZ基因并优化了dCas9-RpoZ的表达及靶向位点。利用建立的crispra系统对重要生物燃料——异戊烯醇的生物合成途径进行了工程改造,该系统不仅能够实现单基因或多基因的高表达,还可以同时对不同基因进行转录激活和抑制,将蓝细菌中异戊烯醇的产量提高了17倍,展示了该系统有望成为构建光能自养细胞工厂的有力工具。

关键词：蓝细菌 crispra 异戊烯醇

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Perspectives on gene expression regulation techniques in Drosophila

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Journal of Genetics and Genomics 2019年第4期46卷 213-220页

作者： Rong-Gang Xu Xia Wang Da Shen Jin Sun Huan-Huan Qiao Fang Wang Lu-Ping Liu Jian-Quan Ni Gene Regulatory Lab School of MedicineTsinghua University Tsinghua University-Peking University Joint Center for Life Sciences Department of Genetics Harvard Medical School Howard Hughes Medical Institute Tsingdao Advanced Research Institute Tongji University

Gene expression regulation, including loss-of-function and gain-of-function assays, is a powerful method to study developmental and disease mechanisms. Drosophila melanogaster is an ideal model system particularly well-equipped with many genetic tools. In this review, we describe and discuss the gene expression regulation techniques recently developed and their applications, including the CRISPR/Cas9-triggered heritable mutation system, CRISPR/dCas9-based transcriptional activation(crispra) system,and CRISPR/dCas9-based transcriptional repression(CRISPRi) system, as well as the next-generation transgenic RNAi system. The main purpose of this review is to provide the fly research community with an updated summary of newly developed gene expression regulation techniques and help the community to select appropriate methods and optimize the research strategy.

关键词： Drosophila Genome editing system crispra CRISPRi Transgenic RNAi system

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CRISPR/dCas-mediated gene activation toolkit development and its application for parthenogenesis induction in maize

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Plant Communications 2023年第2期4卷 56-64页

作者： Xiantao Qi Huimin Gao Renyao Lv Wenbo Mao Jinjie Zhu Changling Liu Long Mao Xinhai Li Chuanxiao Xie Institute of Crop Science Chinese Academy of Agricultural SciencesNational Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic ImprovementBeijing 100081 China Hainan Yazhou Bay Seed Lab Hainan Province 572024 China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-Cas systems can be engineered as programmable transcription factors to either activate(crispra)or inhibit transcription.Apomixis is extremely valuable for the seed industry in breeding clonal seeds with pure genetic backgrounds.We report here a CRISPR/dCas9-based toolkit equippedwith dCas9-VP64 andMS2-p65-HSF1 effectors that may specifically target genes with high activation capability.We explored the application of in vivo crispra targeting of maize BABY BOOM2(ZmBBM2),acting as a fertilization checkpoint,as a means to engineer parthenogenesis.We detected ZmBBM2 transcripts only in egg cells but not in other maternal gametic cells.Activation of ZmBBM2 in egg cells in vivo caused maternal cell-autonomous parthenogenesis to produce haploid seeds.Our work provides a highly specific gene-activation crispra technology for target cells and verifies its application for parthenogenesis induction in maize.

关键词： crispra ZmBBM2 egg cell apomixis engineering maternal haploid

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Genomic and transcriptional changes in response to pinene tolerance and overproduction in evolved Escherichia coli

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Synthetic and Systems Biotechnology 2019年第3期4卷 113-119页

作者： Fu-Xing Niu Yuan-Bin Huang Liang-Nian Ji Jian-Zhong Liu Institute of Synthetic Biology MOE Key Laboratory of Bioinorganic and Synthetic ChemistrySchool of Life SciencesSun Yat-Sen UniversityGuangzhou 510275China

α-Pinene is an important monoterpene,which is widely used as a flavoring agent and in fragrances,pharmaceuticals and biofuels.Although an evolved strain Escherichia coli YZFP,which had higher tolerance to pinene and titer,has been successfully used to produce high levels of pinene,the pinene titer is much lower than that of hemiterpene(isoprene)and sesquiterpenes(farnesene)to date.Moreover,the overall cellular physiological and metabolic changes caused by higher tolerance to pinene and overproduction of pinene remains unclear.To reveal the mechanism of Escherichia coli YZFP with the higher tolerance to pinene and titer,a comparative genomics and transcriptional level analyses combining with CRISPR activation(crispra)and interference(CRISPRi)were carried out.The results show that the tolerance to pinene and the overproduction of pinene in E.coli may be associated with:1)the mutations of the DXP pathway genes,the rpoA and some membrane protein genes,and their upregulations of transcription levels;and 2)the mutations of some genes and their downregulation of transcriptional levels.These comparative omics analyses provided some genetic modification strategies to further improve pinene production.Overexpression of the mutated cbpA,tabA,pitA,rpoA,sufBCDS,mutS,ispH,oppF,dusB,dnaK,dxs,dxr and flgFGH genes further improved pinene production.This study also demonstrated that combining comparative omics analysis with crispra and CRISPRi is an efficient technology to quickly find a new metabolic engineering strategy.

关键词： Comparative omics analysis crispra CRISPRi Pinene Escherichia coli Biosynthesis

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模式动物果蝇的基因调控前沿技术

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遗传 2022年第1期44卷 3-14,I0001页

作者：韩玉婷许博文李羽童卢心怡董习之邱雨浩车沁耘朱芮葆郑丽李孝宸司绪倪建泉清华大学医学院基因表达与调控实验室北京100084

转基因调控技术在生命医学研究中扮演了重要的角色,是探究个体发育和致病机制的必备工具。常用的转基因调控技术包括基因突变、基因干扰和基因转录激活等。果蝇由于具有基因的保守性、遗传工具的多样性以及不受伦理限制等优势,成为生命... 详细信息

转基因调控技术在生命医学研究中扮演了重要的角色,是探究个体发育和致病机制的必备工具。常用的转基因调控技术包括基因突变、基因干扰和基因转录激活等。果蝇由于具有基因的保守性、遗传工具的多样性以及不受伦理限制等优势,成为生命科学研究中经典模式动物之一,并由此开发出了多种时间和组织特异性的基因调控工具。本文主要介绍了目前在果蝇中常用的基因调控技术,包括CRISPR/Cas9介导的基因突变系统、基于miRNA的新一代转基因干扰系统以及基于CRISPR/dCas9的转录激活(flySAM)系统,希望通过对这几种系统设计原理、操作过程、相关的技术工具及相关资源品系的介绍,提升人们对这些前沿的果蝇遗传学基因表达调控技术及构建的相关果蝇资源品系重要性认识,进而推动生命医学研究发展。

关键词：果蝇基因调控 CRISPR/Cas9 基因编辑转基因RNAi crispra

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希瓦氏菌中CRISPR/dCas9-RpoD介导的同时转录激活和抑制

希瓦氏菌中CRISPR/dCas9-RpoD介导的同时转录激活和抑制

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作者：牛小龙天津大学

学位级别：硕士

电活性微生物(EAMs)通过细胞外电子转移(EET)途径与环境交换电子。EAMs的高效EET通常是多功能生物电化学系统在能源和环境领域实际应用的先决条件。Shewanella oneidensis MR-1是EAMs中的模式菌之一,广泛用于EET机制和应用研究。而EET... 详细信息

电活性微生物(EAMs)通过细胞外电子转移(EET)途径与环境交换电子。EAMs的高效EET通常是多功能生物电化学系统在能源和环境领域实际应用的先决条件。Shewanella oneidensis MR-1是EAMs中的模式菌之一,广泛用于EET机制和应用研究。而EET过程与多种复杂的细胞活动有关,其中涉及大量基因。然而,由于缺乏转录激活工具,对多基因的同时调控既费时又费力,这阻碍了提高S.oneidensis EET效率的进展。因此,迫切需要在S.oneidensis MR-1中开发一种易于操作的多模式调节工具。在本文中,我们开发了一种基于CRISPR的多基因调控系统,用于同时激活(crispra)和抑制(CRISPRi)S.oneidensis的基因。首先,通过筛选最佳激活蛋白并确定有效激活范围来实现基因的激活。其次,我们通过设计sg RNA靶向到基因开放阅读框,在d Cas9携带着Rpo D的情况下实现了转录抑制。第三,通过正交两条靶向不同位置的sg RNA实现同时基因激活和抑制。这种基于CRISPR的多基因组合调控系统成功地用于同时激活细胞分裂基因(Min CDE)和抑制细胞毒性基因(SO＿3166),将微生物燃料电池的功率密度提高2.5倍,有机污染物的降解速率提高2.9倍。这种易于操作、多功能的组合调控工具不仅填补了转录激活工具的空白,而且实现了S.oneidensis MR-1中多个基因的同时转录激活和抑制,为EET提供了一种简单灵活的多基因组合调控方法。

关键词： Shewanella oneidensis MR-1 crispra 多基因调控细胞外电子转移生物修复

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以crispra诱导人胚胎干细胞分化为巨噬细胞的研究

以CRISPRa诱导人胚胎干细胞分化为巨噬细胞的研究

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作者：韦添元哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

巨噬细胞广泛存在于人体各种组织中,是免疫系统重要的组成部分。目前对于人类巨噬细胞的大部分研究都源于小鼠模型,但小鼠和人类的巨噬细胞在功能上存在很大的差异。而传统的人源供体和化学分子诱导人多能干细胞分化获得巨噬细胞的方法... 详细信息

巨噬细胞广泛存在于人体各种组织中,是免疫系统重要的组成部分。目前对于人类巨噬细胞的大部分研究都源于小鼠模型,但小鼠和人类的巨噬细胞在功能上存在很大的差异。而传统的人源供体和化学分子诱导人多能干细胞分化获得巨噬细胞的方法依然有一定的局限性。因此迫切需要建立一个提供稳定来源的人类巨噬细胞的方法,用于研究人类巨噬细胞的功能和相关疾病模型。这里,我们利用crispra激活内源性转录因子进而诱导人类胚胎干细胞向巨噬细胞分化。通过比较分析人类胚胎干细胞和巨噬细胞的转录组差异,同时对已发表文献的交叉比对,筛选并确定与巨噬细胞分化有关的候选转录因子,包括CEBPA、CEBPB、SPI1和RUNX1。利用crispra激活候选转录因子并且确定不同sg RNA的激活效率后,我们筛选出激活效果最佳的sg RNA导入人类胚胎干细胞,在不同时间点收集RNA样品进行RNA-seq。通过对测序数据的分析发现,对比对照组,crispra在人类胚胎干细胞内激活了4种转录因子基因,进一步的分析结果显示激活RUNX1的第4天引起人类胚胎干细胞明显的分化。综合细胞形态变化、主成分分析和转录组差异化分析,我们确定了RUNX1引发了人类胚胎干细胞的上皮间充质转变,这是多能干细胞分化成巨噬细胞的过渡状态。该研究筛选了巨噬细胞关键转录因子,并利用遗传学方法在人胚胎干细胞中成功激活了这些转录因子,通过激活单个转录因子诱导人胚胎干细胞向巨噬细胞方向的分化方法,为建立人巨噬细胞分化模型提供了参考。

关键词：干细胞分化巨噬细胞转录因子 crispra

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CRISPR/Cas9系统研究进展

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中国生物工程杂志 2017年第10期37卷 86-92页

作者：栗晓飞曹英秀宋浩天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津化学化工协同创新中心合成生物学平台天津300072

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9... 详细信息

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和crispra基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。

关键词： CRISPR/Cas9 基因组编辑 CRISPRi crispra 基因表达调控

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